TP 2. EMBOSS
Slides mostrados en la clase
Software a usar
- EMBOSS
Si están usando su propia computadora (y no una máquina virtual brindada por la materia) lean esto:
Si estás usando tu propia computadora tenés que tener permisos de administrador (saberte la clave) para instalar EMBOSS usando:
sudo apt-get install emboss emboss-data emboss-doc
Objetivos
- Familiarizarse con el uso de herramientas bioinformáticas por línea de comandos.
- Familiarizarse con los formatos característicos de datos biológicos.
- Practicar conceptos aprendidos en el TP 1.
Introduccion al Tema
EMBOSS es una suite bioinformática creada y mantenida por EMBnet que incluye una multitud de herramientas elementales en biología molecular y genética. Algunas ventajas de EMBOSS son:
- Maneja información biológica en varios formatos para realizar distintos tipos de tareas.
- Es muy rápida, lo cual significa que es computacionalmente escalable.
- Si bien cada uno de sus programas individuales podrían ser reemplazados por otros softwares o un script propio, EMBOSS agrupa todos estos programas en un sólo paquete y le provee al usuario una interfaz unificada para todas las aplicaciones.
A continuación se encuentra una lista de 256 programas que contiene EMBOSS y un resumen corto de lo que hace cada uno:
Como obviamente es imposible acordarse de todos estos programas, EMBOSS tiene un comando llamado wossname que permite listar comandos que tengan cierta palabra en su descripción (en inglés).
1) Abran la consola y prueben correr:
wossname dna
Por otro lado, una vez que encuentran un programa que les interesa pueden leer detalladamente como funciona usando el comando tfm (The Funny? Full? Manual).
2) Por ejemplo pueden ejecutar:
tfm jaspscan
El texto que aparece funciona similar al comando less que vimos en el TP 1, donde Space pasa a la próxima página y apretando Q deja de leerlo.
Como mencionamos antes es posible hacer bioinformática sin usar EMBOSS, ya sea porque:
- queremos controlar hasta el último detalle que hace nuestro programa,
- queremos agregar alguna opción que EMBOSS no tiene,
- o simplemente era una tarea simple y no queríamos aprender a usar un programa de EMBOSS para hacerla.
Son todas razones válidas. Lo que queremos que se lleven hoy es que EMBOSS existe y que puede hacer algunas tareas que les van a resultar útiles en el día a día de hacer bioinformática.
Aplicaciones en Biotecnología
En el TP de hoy vamos a familiarizarnos con EMBOSS y algunas herramientas del paquete, aplicándolas al diseño de una estrategia de clonado, puntualmente para diseñar/optimizar proteínas para expresión recombinante heteróloga.
En los últimos años se ha simplificado considerablemente la ejecución del proceso de clonado/expresión. Esto se debe a la aparición de múltiples herramientas de Ingenieria Genética y a la posibilidad de sintetizar largas secuencias de ácidos nucleicos in vitro, lo que quita el peso de levantar un gen de interés o el riesgo de meter errores durante la PCR que ejecutamos para hacerlo.
Una de las industrias biotecnológicas más antigua es la industria alimenticia. Centenares de microorganismos distintos y decenas de enzimas son utilizados en esta industria para distintos procesos. Algunos de estos procesos son muy complejos, como la fermentación de un vino, mientras que otros son simples y puntuales, como la degradación de lactosa en productos lácteos para personas intolerantes a este azúcar. Los procesos enzimáticos simples pueden resolverse fácilmente mediante la producción de la enzima de interés en forma heteróloga.
Con el fin de dar rienda suelta a nuestro emprendedor interior, montaremos las bases de una empresa biotecnológica: vamos a producir enzimas. La primera enzima que queremos producir es la VpVan, la cual es la encargada de convertir el ácido ferúlico en vanillina. El ácido ferúlico se puede recuperar en grandes cantidades de residuos agroindustriales, como el salvado de trigo y arroz. La vainillina es un compuesto de alto interés económico debido a su uso como saborizante (a que no adivinan que sabor tiene).
Archivos FASTA
Esta enzima ha sido aislada (y secuenciada) a partir de Vanilla planifolia. Encontrarán la secuencia correspondiente entre sus materiales de trabajo (VpVAN.fasta) y más información sobre el descubrimiento en este paper.
Por si no lo saben o no lo recuerdan, el formato FASTA es la forma más usada para trabajar secuencias biológicas (ADN, ARN, aminoácidos) en forma digital. Son archivos de texto plano, donde se asume un formato muy sencillo de interpretar para el ojo humano:
Un archivo FASTA tiene dos elementos importantes:
- Header: Está indicado con un > . Es la línea con el nombre o identificador de la secuencia. Puede contener información adicional como alguna descripción extra sobre la secuencia, tal como las condiciones en que fue obtenida u otra descripción opcional.
- Secuencia: El resto de las líneas que continúan contienen la secuencia propiamente dicha. El largo de cada fila de la secuencia no significa nada; una secuencia de 800 aminoácidos puede ser escrita en una sola línea de 800 aminoácidos o en 10 líneas de 80 aminoácidos cada una. La secuencia sigue hasta el próximo > o hasta el final del archivo, lo que pase primero.
Info
Cuando un FASTA tiene más de una secuencia se lo denomina multiFASTA. En los archivos multiFASTA cada secuencia tiene su header y su secuencia propiamente dicha.
Repaso biológico
Nuestro objetivo en esta guía va a ser diseñar una secuencia de ADN sintético que:
- Exprese VpVan
- Tenga sitios de corte para enzimas de restricción para que pueda ser insertado en un plásmido o vector de expresión de un organismo huésped. En este caso, dichos sitios de corte van a pertenecer a diferentes enzimas de restricción para facilitar la inserción del gen en el sentido correcto
- Marque a VpVan de alguna forma para facilitar su posterior purificación
A continuación vamos a dar una versión super resumida de los conceptos anteriores. Si ya saben como funciona todo lo mencionado pueden ir a la próxima sección (Bases del experimento).
Repaso biológico - Plásmidos
Plásmidos
Los plásmidos son moléculas de ADN de forma circular presentes principalmente en bacterias, arqueas y levaduras. Estas moléculas se encuentran fuera de los cromosomas y se replican de manera autónoma.
Debido a estas características, es posible generar plásmidos artificiales con el objetivo de amplificar (vector de clonación) o de expresar (vector de expresión) un gen de interés. Esto generalmente se realiza cuando la expresión de dicho gen en su organismo original no es factible, ya sea por problemas de volumen, logística o ética.
Los principales componentes de vector de expresión son:
- Origen de la replicación: punto inicial para la replicación del plásmido
- Gen de resistencia a antibióticos: gen que se expresa y da resistencia al organismo huésped, permite quedarnos solo con los organismos que tienen el plásmido dentro de ellos
- Promotor: controla la transcripción de una determinada secuencia (en este caso el gen insertado)
- Sitio de restricción: secuencia que es cortada por una enzima de restricción y donde será insertado el gen de interés (más de esto a continuación)
Repaso biológico - Enzimas de Restricción
Enzimas de Restricción
Las enzimas de restricción son proteínas que reconocen una secuencia específica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortan el ADN en ese punto en concreto o en un punto cercano. A esas secuencias de ADN se las denomina sitios de restricción y tienen entre cuatro a seis pares de bases.
Hay dos grandes grupos de enzimas de restricción, aquellas que dejan extremos cohesivos y aquellas que dejan extremos romos:
Al momento de insertar genes en plásmidos se usan generalmente enzimas de restricción que dejan extremos cohesivos ya que facilitan la inserción del gen debido a su especificidad y a que pueden volverse a unir espontaneamente.
La idea detrás de su uso es colocar un sitio de restricción en el plásmido y colocar el mismo sitio de restricción a cada lado del gen de interés (en el ADN que uno sintetiza). Luego los plásmidos vacios se colocan en una solución con el ADN sintético y se les agrega la enzima de restricción correspondiente que va a cortar el ADN dejando los extremos cohesivos en cada sitio de restricción.
Como el sitio de restricción es el mismo en el plástido y en la secuencia de ADN, es posible entonces que el ADN sintético se inserté en el plásmido, ya sea espontaneamente o ayudado por una ligasa. Esta página tiene muy buenos esquemas sobre el proceso.
En el experimento anterior, luego de cortar el sitio de restricción con la enzima, pueden pasar tres cosas:
- El plásmido se vuelve a cerrar sin ningun inserto
- Se inserta el gen de interés en la dirección correcta (respecto al promotor en el plásmido)
- Se inserta el gen de interés en la dirección contraria (respecto al promotor en el plásmido)
Es posible evitar el caso donde el gen se inserta en la dirección contraria combinando 2 enzimas de restricción diferentes, donde ahora va a haber 2 sitios de restricción en el plásmido (uno para cada enzima) y los dos sitios de restricción en el ADN sintético van a ser diferentes (uno para cada enzima, en el mismo orden que en el plásmido). Si bien en esta versión no es posible que el gen sea insertado en la dirección contraria, sí es posible que se vuelva a insertar el fragmento de plásmido entre los sitios de restricción, pero hay formas de controlar estos casos. Cuando usamos 2 enzimas de reestricción en esta forma decimos que estamos "clonando en forma direccional".
Danger
Es importante cuando se usan enzimas de restricción asegurarse que no haya ningún sitio de corte para las enzimas elegidas en el plásmido ni en el ADN sintético fuera de los sitios involucrados en el proceso de inserción (ya que de existir también serán cortados y la inserción fracasará).
Repaso biológico - Purificación y Tags
Purificación y Tags
Una vez que nuestros organismos huésped tienen el vector de expresión con el gen de interés, se los deja crecer, reproducirse y expresar la proteína de interés en grandes cantidades. Una vez hecho esto, es necesario extraer esa proteína de la solución, lo que no es trivial.
Hay varias formas de purificar proteínas y una de ellas es la cromatografía por afinidad, la cual se basa en la unión reversible entre el analito de interés (en nuestro caso la VpVan) y un ligando específico, inmovilizado en un soporte sólido inerte. Cuando la muestra pasa por la columna, sólo son retenidas las moléculas que se unen de manera selectiva al ligando por afinidad y las que no se unen avanzan con la fase móvil. La figura a continuación muestra un ejemplo donde se usan anticuerpos inmovilizados en una columna para purificar a la proteína roja del resto de la solución:
Uno podría asumir entonces que para poder construir estas columnas es necesario conseguir un ligando que reconozca a nuestra proteína de interés. Si bien esto es teóricamente cierto, como nosotros estamos sintetizando el ADN desde cero podemos pensar lateralmente y agregarle a nuestra proteína una secuencía aminoacídica en uno de sus extremos para la cual ya conozcamos ligandos. Estas secuencias pueden ser desde pocos aminoácidos hasta a proteínas pequeñas y son denominadas tags.
Bases del experimento
Volviendo a nuestro experimento, queremos insertar el gen de VpVan en un vector de expresión. Nuestro organismo huésped es:
- E. coli BL21
Como queremos clonar en forma direccional tenemos que usar dos enzimas de restricción. En el laboratorio están disponibles:
- BamHI
- ApoI
- HindIII
Al momento de purificar necesitamos agregarle un tag a la proteína. Vamos a probar 3 tags diferentes:
- FLAG-tag
- His-tag
- MBP-tag
Por cuestiones de practicidad, todos los tags van a estar en el C-terminal.
En los siguientes ejercicios vamos a:
- Ejercicio 1: Generar secuencias quiméricas VpVan-Tag agregando diferentes tags de interés a la secuencia proteíca de VpVan
- Ejercicio 2: Obtener el genoma del organismo huésped E. coli BL21 (necesario para el Ejercicio 3)
- Ejercicio 3: Generar una tabla de frecuencia de uso de codones del organismo huésped
- Ejercicio 4: Generar la secuencia nucleotídica VpVan-Tag con los codones optimizados para el organismo huésped
- Ejercicio 5: Verificar que no hayan quedado sitios de corte para nuestras enzimas de restricción dentro de la secuencia VpVan-Tag optimizada y luego agregar los sitios de restricción en los bordes de la secuencia
Ejercicio 1. Secuencias aminoacídicas VpVan-Tag
Vamos a generar las secuencias de aminoácidos quiméricas VpVan-Tag (donde Tag = FLAG/His/MBP). Para esto van a necesitar los siguientes archivos que se encuentras en sus materiales de trabajo:
- VpVan.fasta
- FLAG-tag.fasta
- His-tag.fasta
- MBP-tag.fasta
Es altamente recomendado que creen diferentes carpetas para los diferentes TPs y en algunos casos para los diferentes ejercicios (especialemente en este). El nombre y la ubicación lo pueden decidir ustedes, pero un ejemplo para este ejercicio sería ~/Documentos/TP_02/EJ_1. Una vez creada la carpeta para este ejercicio, muevan los cuatro archivos anteriores a dicha carpeta.
Tip
Recuerden que es preferible no usar espacios al crear directorios o archivos
Nuestro objetivo ahora es crear 3 nuevos archivos FASTA que contengan las diferentes construcciones (VpVan + cada uno de los tags). Vamos a llamarlos VpVan-FLAG-tag.fasta y similar (reemplazando el nombre del tag en cada caso).
Ahora bien, como son solo 3 tags esto se podría hacer a mano copiando y pegando, pero es un buen momento para profundizar en dos conceptos que aprendimos la clase pasada: scripts y ciclos.
1) Creen un archivo vacío de texto en esa carpeta y llamenlo agregar_tags.sh. Dentro del archivo pongan lo siguiente:
vpvan_sequence=`cat VpVAN.fasta | grep -v ">"`
lista_de_archivos_tags=`ls *-tag.fasta`
for archivo_tag in $lista_de_archivos_tags
do
tag_sequence=`cat $archivo_tag | grep -v ">"`
new_header=">VpVAN-$archivo_tag"
combined_sequence="$vpvan_sequence$tag_sequence"
echo "$new_header" > VpVAN-$archivo_tag
echo "$combined_sequence" >> VpVAN-$archivo_tag
done
# Aca estamos ejecutando comandos de Linux y guardando su output en una variable
# En estos casos hay que rodear a los comandos con ` (acento grave o comilla invertida)
# Leemos el FASTA de VpVAN y nos quedamos solo con la secuencia
# (estamos removiendo con grep cualquier linea que tenga >, que aca es solo el header)
vpvan_sequence=`cat VpVAN.fasta | grep -v ">"`
# Creamos una lista que contiene a todos los archivos que terminan con -tag.fasta
# (esto va a mirar solo archivos que estén en la carpeta donde se corre el script)
lista_de_archivos_tags=`ls *-tag.fasta`
# Este es una estructura a la que llamamos *for each* en el TP 1. Es un *for*, pero en vez de tener
# una cantidad determinada de ciclos, recorre cada uno de los elementos de una lista
for archivo_tag in $lista_de_archivos_tags
do
# Leemos el FASTA del tag y nos quedamos solo con la secuencia
tag_sequence=`cat $archivo_tag | grep -v ">"`
# Creamos una variable que almacene el nuevo header para la secuencia de VpVAN + tag
new_header=">VpVAN-$archivo_tag"
# Calculamos la nueva secuencia VpVAN + tag
combined_sequence="$vpvan_sequence$tag_sequence"
# Escribimos el nuevo header y la nueva secuencia en un nuevo archivo
echo "$new_header" > VpVAN-$archivo_tag
echo "$combined_sequence" >> VpVAN-$archivo_tag
done
Como recordatorio del TP 1:
catlee archivos de texto y los escribe en la consola|desvia la salida de un programa para que funcione como entrada del siguientegrepfiltra texto, quedandosé solo con aquellas líneas que contengan un texto dado (y de usar la opción-vse queda solo con aquellas que no lo contengan)lslista los archivos y carpetas dentro del directorio actualechoescribe un texto por consola>desvia la salida que íria a consola hacia un archivo de texto, sobrescribiendolo>>desvia la salida que íria a consola hacia un archivo de texto, sin sobreescribirlo (agrega lineas al final)for,in,doydoneson todas partes del ciclo for each. El código entredoydonese va a repetir por cada elemento en$lista_de_archivos_tags, donde en cada iteración la variable$archivo_tagtoma el valor de uno de esos elementos
Hay dos cosas en este script que no vimos en el TP 1. La primera es que estamos ejecutando comandos de Bash y guardando su salida en variables. En estos casos es necesario rodear el comando con `, llamado acento grave o comilla invertida. Por ejemplo:
variable=`comando -opciones parametro1 parametro2`
La segunda novedad es el uso de * con el comando ls. En todo lo que es Linux el caracter * funciona como comodín, tomando cualquier valor. Esto quiere decir que ls *-tag.fasta va a listar todos los archivos cuyos nombres terminen con "-tag.fasta", sin importar como empiecen (pueden probar correr el comando ls *-tag.fasta a mano en la consola y ver que devuelve).
¿Entienden ahora lo que hace el script? Lean la pestaña Código con comentarios para aclarar cualquier duda que tengan sobre él (y si todavía no se entiende no duden en preguntar).
2) Ahora abran la consola y corran el script que acabamos de crear, generando así los nuevos 3 archivos.
Tip
Recuerden que los script se corren con bash ARCHIVO_SCRIPT
¡Ya tenemos nuestras secuencias quiméricas!
Tip
Este script va a dar problemas si se lo corre multiples veces. Esto se debe a que al correrlo la primera vez estamos creando más archivos que terminan con "-tag.fasta", que en una segunda corrida van a ser detectados por el ls. Si no quieren tener problemas con esto pueden agregar el siguiente código luego de dicho comando: | grep -v "VpVAN"
Ejercicio 2. Genoma de E. coli
Nosotros queremos expresar el gen de un organismo en otro organismo. Si bien el código genético es practicamente universal, diferentes organismos pueden tener preferencia para diferentes codones que generan un mismo aminoácido. Por esta razón, al hacer expresión recombinante heteróloga es una buena idea cambiar los codones del gen de interés para que matcheen mejor con los codones que prefiere el organismo huésped (se modifica el ADN pero se sigue produciendo la misma proteína). El primer paso para realizar esta modificación es conocer cuales son los codones preferidos por dicho organismo.
3) Busquen usando el comando wossname que programas de EMBOSS trabajan con codones (recuerden que está en inglés, asi que tienen que buscar "codon"). Lean la descripción de dichos programas, ¿cual les parece que vamos a usar para calcular la tabla de uso de codones?
Respuesta
cusp, cuya descripción es "Create a codon usage table from nucleotide sequence(s)"
Si leen la descripción del programa, verán que pide una secuencia de nucleótidos, es decir, que necesitamos un FASTA del genoma completo de E. coli (ya que éste es nuestro organismo hospedador).
Un buen lugar para obtener información de genomas, genes, y proteínas es RefSeq, que es una colección curada de secuencias nucleotídicas y sus productos. En su FAQ (Frequently Asked Questions, o preguntas frecuentes) hay una pregunta que es básicamente lo que queremos hacer nosotros:
How can I download RefSeq data for all complete bacterial genomes?
Si bien los comandos que ellos sugieren son un poco complejos, vamos a utilizarlos y tratar de explicarlos lo mejor posible.
Tip
Antes de seguir les recomendamos crear una carpeta nueva para este ejercicio, por ejemplo ~/Documentos/TP_02/EJ_2.
RefSeq - Paso 1 - Bajar y filtrar la tabla con los genomas
4) El primer paso indicado en el FAQ es descargar el archivo assembly_summary.txt y ponerlo en la carpeta de este ejercicio. Esto lo pueden hacer desde la página de RefSeq a mano o abriendo la consola en la carpeta de este ejercicio y corriendo:
wget ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/bacteria/assembly_summary.txt
Question
¿Qué piensan que hace wget? ¿Cómo pueden averiguarlo si no lo saben?
Warning
Si el comando wget tarda mucho o ven que tiene errores bajensé este archivo desde este link
Una vez descargado ese archivo (que pesa bastante) queremos ver sus contenidos. Sabiendo que es un archivo que tiene más de 250.000 líneas:
5) ¿Qué comando usarían para ver que tipo de datos tiene adentro? Pruébenlo.
Dado que es un archivo con muchas columnas, probablemente les cueste entender lo que están viendo aunque hayan usado el comando correcto.
Para entender la estructura de nuestro archivo vamos a crear un archivo temporal que tenga sólo las primeras 20 filas de este archivo:
head -20 assembly_summary.txt > assembly_summary_temporal.tsv
Lo único que les debería llamar la atención del comando anterior es que el nuevo archivo tiene la extensión tsv. Esto lo mencionamos por arriba en el TP 1, pero los archivos TSV o "Tab-Separated Values" son archivos de texto que contienen una tabla donde sus columnas están separadas entre ellas por un Tab, lo cual es exactamente el caso de la tabla actual.
Hagan doble click sobre el archivo assembly_summary_temporal.tsv.
- Identifiquen la columna correspondiente a la especie (son solo las primeras 20 filas, no van a encontrar a E. coli), la cepa y el link a la ubicación del genoma.
6) Ahora que conocen la estructura de la tabla, y sabiendo que tiene muchos mas organismos que E. coli, tenemos que filtrar el archivo y quedarnos solo con nuestro organismo y cepa de interés. Para esto, corran los siguientes comandos uno a la vez:
head -2 assembly_summary.txt > assembly_summary_coli.tsv
grep "Escherichia coli" assembly_summary.txt | grep "BL21" >> assembly_summary_coli.tsv
# Generamos un nuevo archivo con el header de la tabla (que en este caso son 2 filas)
head -2 assembly_summary.txt > assembly_summary_coli.tsv
# Buscamos dentro del archivo las filas que contengan "Escherichia coli" y "BL21" y
# las agregamos a la nuevo archivo
grep "Escherichia coli" assembly_summary.txt | grep "BL21" >> assembly_summary_coli.tsv
RefSeq - Paso 2 - Crear un archivo con links a las carpetas de los genomas
7) Ahora que tenemos y entendemos la tabla con nuestros datos de E. coli la podemos abrir en Gnumeric haciendo doble click. Van a ver que no hay solo un genoma de E. coli BL21, sino varios, por lo cual nuestro objetivo de crear una tabla de codones acaba de volverse un poco más complicado. Lo que vamos a hacer entonces es bajar todos los genomas de E. coli BL21 que vemos en la tabla.
Sólo para los más curiosos! Si te interesa saber como usamos awk para hacer este paso lean esto:
awk -F "\t" '{if ($12=="Complete Genome" && $11=="latest") {print $20}}' assembly_summary_coli.tsv > ftpdirpaths
Al comando awk lo vimos brevemente al final del TP 1 y sirve para trabajar con tablas en Bash (entre otras cosas). Las diferentes partes de este comando son:
-F "\t"indica que el separador de columnas es\t, o sea, Tab$12=="Complete Genome"es una condición que filtra las filas, quedándose solo con aquellas donde la columna 12 (assembly_level) es "Complete Genome"$11=="latest"es una condición que filtra las filas, quedándose solo con aquellas donde la columna 11 (version_status) es "latest"&&se denomina and y une ambas condiciones, pidiendo que ambas se cumplan para que la condición total se cumpla{print $20}indica que se va a devolver la columna 20 (ftp_path, contiene el path del genoma, o sea, la carpeta)
Este comando va a crear el archivo ftpdirpaths, que contiene links a las carpetas que contienen los genomas.
- Investiguen cuantos links quedaron en ftpdirpaths. ¿Entienden por qué? Sino consulten.
RefSeq - Crear un archivo con links a los genomas
Los links que tenemos de momento tienen el formato:
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/833/145/GCF_000833145.1_ASM83314v1
Sin embargo, estos son links a las carpetas que contienen los genomas. Siguiendo las instrucciones del FAQ de RefSeq podemos crear el link de los genomas, que para el ejemplo anterior sería:
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/000/833/145/GCF_000833145.1_ASM83314v1/GCF_000833145.1_ASM83314v1_cds_from_genomic.fna.gz
Donde el nombre del archivo es el nombre de la última carpeta + "_cds_from_genomic.fna.gz"
Los archivos terminados en .fna.gz son secuencias en formato FASTA (f) de nucleótidos (na) comprimidas (gz).
Hay varias formas de crear estos nuevos links. Nosotros lo vamos a hacer de la siguiente manera:
awk -F "/" '{print $0 "/" $10 "_cds_from_genomic.fna.gz"}' ftpdirpaths > ftpfilepaths
Donde:
-F "/"indica que el separador de columnas es/. Lo que está haciendo este código es leer nuestros paths como si fueran tablas de varias columnas, haciendo que cada carpeta quede en su propia columna.$0parecería indicar la columna 0, pero las columnas enawkvan de 1 en adelante ($1,$2, etc). El índice$0es un índice especial que devuelve toda la fila (que en este caso es todo el path a la carpeta del genoma).$10es la columna 10, la cual contiene el nombre del genoma (es el nombre de la última carpeta en el path).printva a concatenar$0(el path a la carpeta del genoma),"/"(una barra para separar los directorios),$10(la primera parte del nombre del archivo a descargar) y"_cds_from_genomic.fna.gz"(la segunda parte del nombre del archivo a descargar).awkva a hacer esto por cada fila del archivo ftpdirpaths.
Una vez que entienden lo que hace este comando abran la terminal y corranló.
Por si se quedaron con curiosidad de el comando que proponía el FAQ de RefSeq
El comando awk que sugeria el FAQ de RefSeq es un poco más complejo, pero llegaba al mismo resultado. Noten que en este comando el archivo tiene la extensión .gbff.gz que hace referencia al formato de GenBank, que no es el con el que vamos a trabajar. Hay que cambiarlo por "cds_from_genomic.fna.gz"
awk 'BEGIN{FS=OFS="/";filesuffix="genomic.gbff.gz"}{ftpdir=$0;asm=$10;file=asm"_"filesuffix;print ftpdir,file}' ftpdirpaths > ftpfilepaths
No es necesario que lo entiendan 100%, pero vamos a aclarar algunas cosas:
BEGINsignifica que las cosas entre las primeras llaves se van a ejecutar solo una vez, y no una vez por fila (como el resto).FSes una variable interna deawkque indica como se separan las columnas en la tabla a leer (es equivalente a usar-F). La variableOFSindica lo mismo, pero para la salida deawk. ConFS=OFS="/"estamos indicando que ambos serán la barra/. Lo que está haciendo este código es leer nuestros paths como si fueran tablas de varias columnas, haciendo que cada carpeta quede en su propia columna.- En
filesuffix="cds_from_genomic.fna.gz"está definiendo una variable en la que va a almacenar la cadena de texto que queremos agregar al final de cada link. - En
ftpdir=$0está definiendo una variable en la que parece almacenar la columna 0. Ahora bien, las columnas enawkvan de 1 en adelante ($1,$2, etc), pero el índice$0es un índice especial que devuelve toda la fila (que en este caso es todo el path a la carpeta del genoma). - En
asm=$10está definiendo una variable en la que va a almacenar la columna 10, la cual contiene el nombre del genoma (es el nombre de la última carpeta en el path). - En
file=asm"_"filesuffixestá definiendo una nueva variable como la concatenación deasm, un guión bajo yfilesuffix. Este va a ser el nombre del archivo a descargar (pero todavía le falta el path). print ftpdir,fileva a imprimir el valor deftpdir(el path a la carpeta del genoma) seguido por el valor de file (el nombre del archivo a descargar) por cada fila del archivo ftpdirpaths. La barra entre ambos (/) es agregada automaticamente debido a que declaramosOFS="/"al principio.
RefSeq - Paso 3 - Descargar genomas de E. coli
8) Ya falta poco para tener nuestros genomas, solo hay que descargar todos los links que tenemos adentro del archivo ftpfilepaths.
Esto se puede hacer usando el comando wget. Ahora bien, por defecto a wget hay que pasarle un link de descarga como hicimos arriba, pero por suerte existe una opción que permite pasarle un archivo de entrada y que descargue todos los links que se encuentran en él.
-
Usen
wget -h(mas conciso) oman wget(mas extenso) para ver las diferentes opciones dewget, encuentren la que se usa para pasarle un archivo de entrada (o fichero o input file) con links (o URLs) y usenwgetcon ftpfilepaths para bajar todos los genomas que seleccionamos.Tip
wgettiene bastantes opciones, asi que para hacerla un poco más fácil sepan que la opción que necesitan es una de las 15 primeras y está en la sección Ficheros de registro y de entrada (o Logging and input file)
Este comando puede tardar un rato en descargar todo y va a bajar 11 archivos con extensión .fna.gz donde .fna es una extensión que hace referencia a que el archivo contiene información de secuencia (similar a FASTA) y .gz es la extensión de los archivos comprimidos de Linux.
Ejercicio 3. Construir tabla de frecuencias de uso de codones
Tras lo que parece una eternidad por fin tenemos nuestros genomas. Ahora es momento de usar el comando cusp del que hablamos al principio del ejercicio anterior para transformar nuestros genomas en tablas con frecuencias de uso de codones.
Como tenemos varios archivos .fna.gz vamos a tener que correr el comando cusp varias veces, y la mejor forma de hacer esto es creando un script con un ciclo for each que lo haga por nosotros. Este ciclo va a recorrer todos los archivos .fna.gz que acabamos de descargar, los va a descomprimir y va a ejecutar el comando cusp para cada uno.
10) Reemplacen los REEMPLAZAR en el próximo código por lo que sea adecuado para conseguir nuestro objetivo:
REEMPLAZAR
for REEMPLAZAR in REEMPLAZAR
do
REEMPLAZAR
done
Sabiendo que un REEMPLAZAR es:
# Creamos una lista que contiene a todos los archivos que empiezan con "GCF" y terminan con ".gz"
lista_de_archivos_genomas=`ls GCF*.gz`
y otro es:
# Descomprimimos el archivo ".gz" y corremos el comando *cusp* para cada $archivo_genoma de la lista
zcat $archivo_genoma | cusp -auto -sequence "stdin" -outfile "${archivo_genoma}.cusp"
zcates un comando que descomprime archivos .gz y devuelve su contenido por consola (similar acat).-autohace quecuspuse los parámetros por defecto y no nos consulte cuales usar.-sequence "stdin"le esta diciendo acuspque el genoma se lo estamos dando por la consola (mediante el pipe o|).-
-outfile "${archivo_genoma}.cusp"define el nombre del archivo de salida decusp, que en este caso es el nombre del genoma seguido de .cusp. Si bien las llaves no son necesarias en este caso, ayudan a entender donde termina la variable y empieza el string. Idealmente habria que sacarle la extensión anterior al archivo (ya que ahora va a quedar .fna.gz.cusp), pero ya tenemos bastante que hacer.Tip
Si no les sale pueden ver el for each del Ejercicio 1 para usarlo como base (si bien ese es más complicado)
11) Una vez creado el script, córranlo.
Si ven que este script tarda mucho tiempo en correr (varios minutos sin indicar que avanza) lean esto:
- Cancelen la corrida apretando Ctrl+C en la terminal
- Usen para la próxima seccion los archivos ecoli_BL21_codon_table_1.cusp y ecoli_BL21_codon_table_2.cusp que se encuentra en sus materiales de trabajo
Comparar tablas de codones
Recordando nuestro objetivo, nosotros queríamos una tabla de codones de E. coli para saber como modificar el ADN de nuestra proteína de interés (VpVan) para que use aquellos codones preferidos por el organismo huésped. En este momento tenemos varias tablas de codones, asi que tenemos que elegir alguna.
Abran uno de los archivos .cusp que acabamos de crear y vean que información tiene:
Si están usando Leafpad y si en la tabla dentro del archivo .cusp las columnas no están alineadas lean esto:
Por defecto Leafpad usa una fuente llamada "Ubuntu", que si bien sirve para escribir cuentos, nos va a dar problemas al momento de ver ciertos archivos que vamos a usar en esta materia.
En Leafpad vayan a Opciones Tipografía..., seleccionen la fuente "Ubuntu Mono" y aprieten Aceptar.
Las fuentes que tienen Mono en su nombre estan indicando que son monoespaciadas, o sea, que todos sus caracteres tienen el mismo ancho. Esto es ideal para cuando se quieren ver tablas o alineamientos con Leafpad, cosa que vamos a hacer bastante en esta materia.
Ayuda-memoria con aminoácidos y sus abreviaturas
| Full Name | Abbreviation (3 Letter) | Abbreviation (1 Letter) |
|---|---|---|
| Alanine | Ala | A |
| Arginine | Arg | R |
| Asparagine | Asn | N |
| Aspartate | Asp | D |
| Aspartate or Asparagine | Asx | B |
| Cysteine | Cys | C |
| Glutamate | Glu | E |
| Glutamine | Gln | Q |
| Glutamate or Glutamine | Glx | Z |
| Glycine | Gly | G |
| Histidine | His | H |
| Isoleucine | Ile | I |
| Leucine | Leu | L |
| Lysine | Lys | K |
| Methionine | Met | M |
| Phenylalanine | Phe | F |
| Proline | Pro | P |
| Serine | Ser | S |
| Threonine | Thr | T |
| Tryptophans | Trp | W |
| Tyrosine | Tyr | Y |
| Valine | Val | V |
- ¿Por qué hay más de un codón para cada aminoácido?
- ¿Qué indica la columna Fraction?
- ¿Qué indica la columna Frequency? (pueden encontra la respuesta usando
tfm cusp, pero está mas claro en la ayuda online) - Ahora abran otro archivo .cusp, ¿notan diferencias entre las frecuencias de uso de codones de los distintos proyectos genoma de E.Coli BL21?
En un principio pareceria que ambos archivos .cusp son bastante parecidos, pero queremos estar seguros. EMBOSS tiene un programa llamado codcmp que permite comparar tablas de codones, calculando ciertos estadísticos. El programa se usa:
codcmp ARCHIVO_CUSP_1 ARCHIVO_CUSP_2 ARCHIVO_SALIDA
12) Usen este comando para comparar los dos archivos .cusp que miraron previamente y guarden la comparación en un archivo llamado cusp_comparison.out.
Abran cusp_comparison.out y vean los estadísticos calculados. ¿Son compatibles estos resultados con nuestras observaciones previas de que ambos archivos .cusp son muy parecidos?
Hay entoces una noticia buena y una mala:
Noticia Buena
Todos las tablas de frecuencias de codones son casi idénticas, asi que podemos usar cualquiera de ellas y va a funcionar bien.
-
Aclaración 1: Los resultados de
codcmpno alcanzan para decir que las diferencias no son "estadisticamente signficativas" (aunque en este caso es bastante obvio). En el manual decodcmpdan algunas ideas para calcular esto. -
Aclaración 2: Otra forma de resolver el "problema" de tener muchas tablas de codones podría haber sido calcular una nueva tabla de frecuencias de codones que sea un promedio de todas las anteriores, pero esto es un trabajo complejo y no se amerita hacerlo para este caso debido a los similar que son las diferentes tablas entre sí.
Noticia Mala
Todos las tablas de frecuencias de codones son casi idénticas, asi que podríamos haber bajado solo una de ellas y ahorrarnos bastante trabajo (aunque no teníamos forma de saber esto previamente).
Ejercicio 4. Optimizar secuencia a insertar en base a la tabla de codones
Ya casi estamos. En este momento tenemos la tabla de frecuencia de uso de codones para E. coli BL21 y queremos aplicar dichos codones a las 3 secuencias quiméricas que creamos en el Ejercicio 1, es decir, codificar una secuencia amionacídica de planta en la forma más óptima para su traducción en E. coli.
Para organizar un poco los archivos volvemos a recomendar crear una carpeta para este ejercicio, por ejemplo ~/Documentos/TP_02/EJ_4. Dentro de la carpeta copien los siguientes archivos:
- VpVAN-FLAG-tag.fasta (creado en el Ejercicio 1)
- VpVAN-His-tag.fasta (creado en el Ejercicio 1)
- VpVAN-MBP-tag.fasta (creado en el Ejercicio 1)
- Elijan alguno de los archivos .cusp creados en el Ejercicio 3, copienlo a la nueva carpeta y cambienlé el nombre a ecoli_BL21_codon_table.cusp.
Ahora bien, para hacer esta optimización de secuencias podemos usar otro de los programas de EMBOSS llamado backtranseq. Este programa toma una secuencia de aminoácidos correspondiente a una proteína de interés y una tabla de frecuencia de uso de codones y usa ambos para hacer una traducción inversa desde la secuencia proteíca hacia la secuencia de ADN que, con mayor probabilidad, le dio origen. Es decir, backtranseq devuelve una secuencia de ADN a partir de una secuencia de aminoácidos. Este comando se usa:
backtranseq -auto -sequence ARCHIVO_PROTEINA_FASTA -cfile ARCHIVO_CUSP -outfile ARCHIVO_SALIDA_ADN_FASTA
13) Corran este comando 3 veces pasándole los archivos correctos y creen los siguientes archivos (si quieren pueden hacer script con un for each, pero no hace falta):
- Ecoli-DNA-VpVAN-FLAG-tag.fasta
- Ecoli-DNA-VpVAN-His-tag.fasta
- Ecoli-DNA-VpVAN-MBP-tag.fasta
Tip
De hacerlo a mano, aca van a tener que ejecutar tres comandos muy similares. Recuerden que pueden usar Up y Down en su terminal para navegar por los ultimos comandos utilizados y modificar lo necesario, así como Tab para autocompletar nombres de archivos. También puede serles útiles la tecla Home (Inicio) y End (Fin) para moverse al principio o al final del comando que están editando.
Ejercicio 5. Agregar enzimas de restricción
El último paso es agregar los sitios de corte de enzimas de restricción a los costados de mi secuencia quimérica, pero antes de eso tengo que asegurarme que dichas enzimas no tengan sitios de corte dentro de mi secuencia. Probablemente ya no les sorprenda que existe un programa de EMBOSS para hacer esto llamado remap; sin embargo, dicho programa necesita que previamente le hayamos pasado a EMBOSS una base de datos de enzimas de restricción.
14) En los materiales de trabajo van a encontrar dos archivos llamados proto.207 y withrefm.207 que contienen la información para crear la base de datos de enzimas de restricción. Copienlos a la carpeta donde estan trabajando y corran el comando:
rebaseextract -infile withrefm.207 -protofile proto.207
Info
Solo para que sepan, los archivos proto.207 y withrefm.207 se pueden descargar de aca o aca usando wget (con los links anteriores van a bajar un índice general y luego tienen que pasarle a wget el link de los archivos que quieran). Dependiendo de cuando vayan a esa página puede ser que encuentren versiones incluso mas recientes.
15) Ahora que ya tenemos la base de datos configurada podemos usar remap, pero antes veamos un poco mas información sobre nuestras enzimas de restricción. Usando grep busquen dentro del archivo proto.207 a nuestras enzimas de restricción de interés (BamHI, ApoI y HindIII).
- ¿Qué longitud tienen los sitios de restricción de ApoI, BamHI y HindIII?
- ¿Qué piensan que significa el símbolo ^ en el sitio de restricción? (pueden buscar información sobre dichas enzimas online y se van a dar cuenta enseguida)
- Observe la secuencia de ApoI, ¿nota algo raro? ¿Qué le parece que indica?
Ahora que sabemos un poco más sobre nuestras enzimas vamos a usar el comando remap con las siguientes opciones:
remap -auto -sequence ARCHIVO_ADN_FASTA -width 80 -commercial -sitelen 6 -frame 1 -enzymes all -outfile ARCHIVO_SALIDA_REMAP
Donde:
-autohace queremapuse los parámetros por defecto y no nos consulte cuales usar.-widthindica el ancho de secuencia a mostrar en el archivo de salida.-commercialanaliza solo las enzimas de restricción de uso comercial (entre las que se encuentran nuestras enzimas de interés).-sitelenindica el mínimo de longitud del sitio de restricción (como sabemos que los sitios de restricción de nuestras enzimas de interés tienen 6 aminoácidos ponemos ese número).frameindica el marco de lectura a traducir (ya que el output tambien va a dar información a nivel proteína). En nuestro caso elframees 1 (estamos en la hebra codificante y hay que traducir a partir del primer nucleótido).enzymesindica los nombres de las enzimas a probar. Si bien podríamos haber puesto nuestras enzimas de interés, ponemosallpara ver más información del output.
Corran este comando 3 veces pasándole los archivos correctos y creen los siguientes archivos:
- enzimas_FLAG.out
- enzimas_His.out
-
enzimas_MBP.out
-
¿Qué le falta a las secuencias?
Respuesta
Le falta la secuencia del codón de STOP después del TAG!
16) Agregá la secuencia faltante después del TAG.
17) Una vez creados, abran los archivos con Leafpad o con el Text Editor.
- ¿Entienden lo que simboliza el archivo? (si no visualizan de manera cómoda el archivo llame al docente)
- Busquen nuestras enzimas de restricción de interés.
- ¿Las encuentran? ¿En que categoría está cada una?
- ¿Se pueden usar entonces cualquiera de nuestras enzimas de restricción para insertar nuestra secuencia en un plásmido?
- ¿Hay algún tag de los tres que estábamos considerando que no se pueda usar debido a las enzimas de restricción que elegimos?
- Elijan el tag que quieren usar, copien su construcción Ecoli-DNA-VpVAN-???-tag.fasta a un nuevo archivo y luego cambienlé el nombre a secuencia_final.fasta.
- Abran secuencia_final.fasta en Leafpad o Editor de Texto y agreguen a mano el sitio de restricción de BamHI al principio y el de HindIII al final.
¡Felicitaciones, tenemos nuestra secuencia lista para mandar a secuenciar!