TP 3. Alineamientos de secuencias de a pares

Atención: Este TP tiene informe.

Atención: Este TP tiene parcialito.

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Objetivos

Entender el funcionamiento básico del algoritmo de alineamiento de pares de secuencias de Needleman-Wunsch.
Aprender a interpretar un Dot-Plot, pudiendo identificar las regiones relevantes que contienen patrones.
Comprender los conceptos de identidad, similitud y homología de secuencias, y establecer una clara diferencia entre los mismos.
Realizar un alineamiento múltiple de secuencias e interpretar qué información importante se puede extraer del mismo.

Introducción

El alineamiento de secuencias de a pares comprende la asignación uno-a-uno de correspondencias entre los elementos que componen dichas secuencias sin alterar su orden. En dicho proceso tres eventos principales pueden tener lugar:

Match (M): Cuando los elementos enfrentados son equivalentes.
Mismatch (m): Cuando los elementos correspondientes son diferentes.
Gap (g): Cuando un elemento de una secuencia no tiene par en la otra y se enfrenta a un espacio, caracterizado por un guión (-).
- Gap open: Cuando se abre un gap.
- Gap extend: Cuando se agregan gaps a continuación de otro gap.

Por ejemplo, si alineamos las secuencias AFGIVHKLIVS y AFGIHKIVS un posible resultado sería:

A F G I V H K L I V S
A F G I - H K - I V S

Los gaps no existen en la realidad. NO son un aminoácido o nucleótido más, sino una herramienta que utilizamos para poder alinear.

La principal función de los alineamientos es establecer una medida de similitud entre las secuencias que participan en el mismo. Para ello es necesario definir un sistema de puntuación que pese cada uno de los eventos que tienen lugar en la construcción del alineamiento. Asimismo, este esquema de puntajes o scoring nos permitirá optimizar el alineamiento de forma tal que los algoritmos empleados elijan la correspondencia entre secuencias que maximice el puntaje o score global.

Existen varios algoritmos de alineamiento:

Los alineamientos globales (o de Needleman-Wunsch por sus creadores), se realizan apareando todos los elementos de una secuencia con todos los elementos de la otra. Este tipo de alineamientos se utiliza principalmente para comparar dos secuencias que son similares en longitud.
Los alineamientos locales (o de Smith-Waterman), parean únicamente parte de las secuencias y son útiles para identificar, por ejemplo, dominios en común.
Los alineamientos mixtos, que combinan los dos anteriores.

Dynamic programming

Dado un par de secuencias y un sistema de puntuación o scoring se pueden aplicar diversos algoritmos para encontrar el alineamiento que dé el mejor puntaje.

El algoritmo más popular utiliza un método matemático llamado dynamic programming. El mismo consiste en comparar ambas secuencias construyendo una matriz del alineamiento. Brevemente:

Se comienza en el extremo superior izquierdo de la matriz, con un puntaje inicial de 0.
En cada paso, se calcula el costo que tiene aparejado desplazarse de una celda a la otra, dado el sistema de puntajes pre-establecido, y se elige la opción más favorable, es decir aquella que maximice el puntaje global del alineamiento.
En cada iteración se guarda el puntaje con el que se llegó a una celda dada y el movimiento que originó dicho camino o path, indicado típicamente con una flecha. Una vez que la matriz está completa en su totalidad se puede recorrer hacia atrás o realizar un traceback, desde el extremo inferior derecho al superior izquierdo, para reconstruir el alineamiento.

La principal ventaja de este método es que siempre encuentra el alineamiento óptimo entre las secuencias dadas.

Sin embargo, una desventaja es pueden existir varios alineamientos que satisfagan esta condición.

Otra desventaja es de origen técnica: la exhaustividad con la que el algoritmo realiza la búsqueda hace que su velocidad dependa de la longitud de las secuencias implicadas, haciendo poco eficiente la búsqueda de similitud de una secuencia contra una base de datos. Para esto existen diferentes adaptaciones del algoritmo que se verán más adelante.

Ejemplo

Imaginen que queremos alinear las secuencias TCGCA y TCCA utilizando un esquema de scoring de:

Match: M=1
Mismatch: m=-1
Gap: g=-2

Para eso ubicamos las secuencias en una matriz, donde cada una de sus dimensiones corresponda a una de las secuencias, tal como se muestra en la siguiente figura.

Si observamos los paths 1 y 2 dibujados en las matrices de la figura podemos ver que se emplearon distintas estrategias para alinear este par de secuencias.

En 1 se eligió alinear los dos primeros nucleótidos TC por la diagonal, luego colocar un gap en la secuencia vertical TCCA y para finalizar se alinearon los nucleótidos CA restantes por la diagonal.
En 2 el primer nucleótido T de ambas secuencias se alineó por la diagonal, luego se colocó un gap en la secuencia vertical TCCA y finalmente se alinearon los 3 nucleótidos GCA y CCA restantes por la diagonal.

Si computamos los puntajes de ambos alineamientos, obtenemos que:

La opción 1 tiene un puntaje de 2. Se propone colocar un único gap permitiendo alinear al resto de los nucleótidos en ambas secuencias con eventos de match.
La opción 2 tiene un puntaje de 0. Las secuencias estudiadas se alinean con 1 gap, 1 mismatch y 3 matches. La estrategia es subóptima en relación a 1.

Pregunta

Si hubiésemos aplicado la metodología de dynamic programming para realizar un alineamiento global de estas secuencias, ¿cuál sería el path óptimo resultante?

A priori uno pensaría que es el path 1, pero hagamos el ejercicio para corroborar si esto es efectivamente así.

Para comenzar, refresquemos cómo funcionaba el método de dynamic programming.

Para llegar desde el extremo superior izquierdo (= inicio) de la matriz del alineamiento a la posición marcada con una x podríamos, hipotéticamente, tomar cualquiera de los caminos dibujados en la figura de más arriba. Estos paths darían alinemientos diferentes de las secuencias TC con TC.

Pregunta

Pero... ¿cuál es el procedimiento iterativo empleado por el método de dynamic programming para obtener el alineamiento óptimo entre dos secuencias?

Para llegar a cualquier celda de la matriz, uno puede acceder por, como máximo, 3 direcciones. La idea es siempre moverse en la dirección que maximice el score o puntaje.

Veamos que :

un movimiento en la dirección horizontal, de la posición (i, j-1) a la posición (i, j), supone introducir un gap en la secuencia del eje vertical i
un movimiento en la dirección diagonal, de la posición (i-1, j-1) a la posición (i, j), supone un match o un mismatch entre los nucleótidos enfrentados
un movimiento en la dirección vertical, de la posición (i-1, j) a la posición (i, j), supone introducir un gap en la secuencia del eje horizontal j

Teniendo en cuenta la fórmula para obtener el score enunciada más arriba, podemos comenzar con nuestro ejercicio!

Recordemos que la matriz se llenará iterativamente, comenzando por la celda del extremo superior izquierdo, que tiene un puntaje de 0.

Para moverse del (0, 0) al (0, 1), hay una sóla opción, moverse en forma horizontal. Esto significa alinear T con un gap, lo cual da un score de 0 + (-2) = -2.

eje j: T
eje i: -

Lo mismo pasa al moverse del (0, 0) al (1, 0), hay una sóla opción, moverse en forma vertical. Esto significa alinear T con un gap, lo cual también da un score de 0 + (-2) = -2.

eje j: -
eje i: T

Para moverse del (0, 0) al (1, 1) hay 3 maneras:

1. Hacer un movimiento vertical, lo cual da un score de -2 + (-2) = -4

-2 es el puntaje de la celda inicial (0, 1)
El movimiento vertical implica colocar un gap: -2

Resultado:

eje j: T -
eje i: - T

2. Hacer un movimiento horizontal, lo cual da un score de -2 + (-2) = -4. Similar al caso anterior:

-2 es el puntaje de la celda inicial (1, 0)
El movimiento horizontal implica colocar un gap: -2

Resultado:

eje j: - T
eje i: T -

3. Hacer un movimiento diagonal, lo cual da un score de 0 + (+1). Implica alinear ambos nucléotidos!

0 es el puntaje de la celda inicial (0, 0)
Hay T en las ambas secuencias. Es un match: +1

Resultado:

eje j: T 
eje i: T

Para decidir qué valor ubicamos en la celda simplemente optamos por el que nos dé el mayor score, en este caso 1, y se marca el movimiento que lo produjo: un movimiento diagonal.

De esta manera podemos seguir completando la matriz,

Obsevando la última celda computada, podemos ver que hay nuevamente 3 maneras de llegar a la misma,

Hacer un movimiento vertical, de (1, 3) a (2, 3): Es decir, introducir un gap en la secuencia horizontal j. Si (1, 3) tiene un score de -3, el nuevo score es: -3 + gap penalty = -3 + (-2) = -5 (flecha en dirección vertical).
Hacer un movimiento horizontal, de (2, 2) a (2, 3). Es decir, introducir un gap en la secuencia vertical i. Si (2, 2) tiene un score de 2, el nuevo score es: 2 + gap penalty = 2 + (-2) = 0 (flecha en dirección horizontal).
Hacer un movimiento diagonal, de (1, 2) a (2, 3). Es decir, alinear los nucleótidos G y C. Si (1, 2) tiene un score de -1, el nuevo score es: -1 + mismatch = -1 + (-1) = -2 (flecha en dirección diagonal).

El máximo de los 3 scores calculados es: max(-5, 0, -2) = 0, que corresponde al puntaje del movimiento horizontal. Entonces colocamos 0 en la celda (2, 3) y una flecha horizontal que indique el movimiento de (2, 2) a (2, 3).

Al completar todas las celdas de la matriz, podemos saber cuál es el puntaje de la celda ubicada en extremo inferior derecho, que en este caso resultó ser +2. Este también es el puntaje final del alineamiento.

Para reconstruir el mismo, se parte de la celda ubicada en extremo inferior derecho y se siguen las flechas hasta llegar a la celda de inicio, en el extremo superior izquierdo.

Las flechas en rojo resaltan el path del alineamiento,

eje j: T C G C A
eje i: T C - C A

que podemos corroborar que es idéntico al path 1 del ejemplo que se planteó inicialmente.

Ejercicio 1

1.1 En grupo, realizá el alineamiento de las secuencias ATTGG con AGATGG, usando el esquema de puntajes: M=1, m=-1, g=-2.

Para esto, abrí el siguiente Google Jamboard, guardá una copia local del mismo en tu Google Drive y compartí el GJamboard a tus compañeros de equipo.

Atención

Para guardar una copia local del GJamboard en tu GDrive, cliqueá en el ícono con 3 puntitos, en el extremo superior derecho (Más acciones). Luego seleccioná la opción "Hacer una copia". Elegí la carpeta adonde deseas guardarlo dentro de tu unidad y cliqueá aceptar.

¡Ahora estás listo para empezar! Recordá rellenar la matriz con todos los puntajes y flechas faltantes. Cuando termines, reconstruí el path del alineamiento.

1.2 Cuando termines el ejercicio anterior podés corrobar la solución que hallaste ingresando en UniFreiburg-FreiburgRNATools.

Seguí las siguientes instrucciones para usar este recurso web:

a. Ingresá las dos secuencias que querés alinear en los recuadros de Input Sequence a y Sequence b. Recordá que la secuencia que figura en tu matriz en sentido horizontal debe ser ingresada como Sequence b y la que figura en sentido vertical debe ser ingresada como Sequence a.

b. Seleccioná optimización de Similarity.

c. Completá los valores de tu esquema de scoring.

En el output podrás apreciar dos salidas:

A la izquierda, los valores de la matriz de alineamiento. Si cliqueas sobre los valores de la matriz, vas a observar que el valor sobre el que te paraste se colorea en verde, mientras que las celdas que dieron origen a ese valor se colorean en rosa.
A la derecha, se observa el alineamiento final, donde un match se esquematiza en con *, un mismatch con | y un gap con _.

1.3 Respondé a las siguientes preguntas:

1.3.1 Reproducí el alineamiento que vimos como ejemplo al inicio (TCGCA con TCCA, esquema de puntajes: M=1, m=-1, g=-2) en la web de la UniFreiburg-FreiburgRNATools

¿Cuántas soluciones óptimas hay para este alineamiento? ¿Sucede lo mismo para el alineamiento que realizaste en el Ejercicio 1.1? ¿Por qué?

1.3.2 Observá con detenimiento el output del panel de la izquierda (la matriz)

Seleccioná una celda. ¿Qué sucede cuando cliqueás en una celda y se colorea en verde y la celda aledaña a la misma en rosa? ¿A qué corresponde este coloreado o resaltado de las celdas?

Observá nuevamente la matriz del alineamiento que obtuviste en 1.2. Cliquéa en la celda con puntaje -2 en la posición (A3, T2). Observá que se colorea en verde y dos celdas aledañas a la misma en rosa.
¿Entendés qué significa esto? ¿Podés relacionarlo con los dos caminos óptimos posibles que existen para este alineamiento?

Dot-Plots

Los dot-plots son representaciones gráficas que dan un pantallazo sobre la similitud entre dos secuencias. En ellos se pueden identificar patrones que aporten información sobre la relación entre ambas secuencias. La forma de obtener uno es muy sencilla: se establece una matriz donde cada elemento de una de las secuencias se corresponde con una fila y los de la otra con una columna. Acto seguido se procede a colorear cada celda donde los caracteres correspondientes a fila y columna sean equivalentes. Por ejemplo:

Nosotros podemos utilizar la herramienta de EMBOSS dotmatcher para generar nuestros propios plots.

Recordatorio

Para ver qué parámetros toma de entrada la función, correr en la terminal dotmatcher -h.

Ejercicio 2

2.1 Utilizá la secuencia HS-ch11-fragment.fasta que se encuentra en la carpeta data para compararla contra sí misma. Esta secuencia es un pequeño fragmento del cromosoma 1 de Homo sapiens y la vamos a utilizar únicamente para ver algunos de los patrones que podemos encontrar en un dotplot.

Generá un dotplot utilizando la secuencia HS-ch11-fragment.fasta contra sí misma.

dotmatcher -graph X11 HS-ch1-fragment.fasta HS-ch1-fragment.fasta

si quieren guardar la imagen:

dotmatcher -graph pdf HS-ch1-fragment.fasta HS-ch1-fragment.fasta

Atención

Recuerden abrir el archivo HS-ch11-fragment.fasta y chequear que la secuencia es de ADN. Es una buena práctica conocer qué hay en los archivos que vamos a utilizar.

¿Qué podés interpretar de este dotplot?

La verdad es que el plot es bastante ruidoso, esto sucede muy a menudo en secuencias genómicas ya que la cantidad de caracteres que componen las secuencias es muy limitada (solo 4) y por ello hay muchas ocurrencias y por lo tanto muchos puntos. Para limpiar el plot y quedarnos con los matches más significativos podemos jugar con dos parámetros:

windowsize: Tamaño de ventana
threshold: Umbral de ocurrencia

Esto quiere decir que dotmatcher sólo va a poner un punto cuando un fragmento del largo windowsize contenga un score mayor a threshold. Por ejemplo:

dotmatcher -graph X11 -windowsize 50 -threshold 20 HS-ch1-fragment.fasta HS-ch1-fragment.fasta

Si aumentás estos parámetros podés ir eliminando fragmentos que corresponden a secciones compartidas más cortas, sin embargo existe una relación de compromiso, utilizar tamaño de ventana y umbral muy grandes nos llevan a perder información por lo que hay que seleccionarlos con cuidado. Aqui hay algunos patrones con los que te podés encontrar en este tipo de plots:

a) Match perfecto.
b) Repeticiones.
c) Palíndromo.
d) Repeticiones invertidas.
e) Zonas de baja complejidad (microsatelites).
f) Zonas altamente repetitivas (minisatelites).
g) Secuencias con alta conservación.
h) Inserción o deleción.

2.2 Cambiá los parámetros windowsize y threshold hasta obtener un plot que te parezca adecuado. ¿Qué podés interpretar del mismo? Identificá patrones.

Identidad, Similitud y Homología

Los términos identidad, similitud y homología se suelen utilizar como sinónimos por muchos investigadores, sin embargo no lo son.

La identidad es una es una característica cuantitativa de un par de secuencias, donde se cuenta cuántos elementos (residuos, nucleótidos, aminoácidos etc) son idénticos entre ambas secuencias después de alinearlas.
La similitud es una característica cuantitativa de un par de secuencias, donde se establece en qué grado estas se parecen (por ejemplo aplicando los algoritmos antes vistos, utilizando un sistema de puntaje) después de alinearlas.
La homología, por otro lado, es una característica cualitativa, dos secuencias SON o NO SON homólogas. Homología implica específicamente que el par de secuencias estudiadas provienen de un mismo ancestro común. Esta afirmación es completamente hipotética, ya que, salvo en contados casos, no se puede corroborar. Uno puede inferir que este es el caso dado la similitud observada en las secuencias actuales, sin tener acceso a las secuencias ancestrales.

Atención

Decir que un par de secuencias tiene N% de homología es TOTALMENTE incorrecto.

A partir de esta relación entre similitud y homología se pueden inferir relaciones entre diferentes especies, buscar posibles funciones de una secuencia desconocida, etc.

Ejercicio 3

3.1 Determinar qué especies están más relacionadas utilizando la ribonucleasa pancreática de caballo (Equus caballus), ballena enana (Balaenoptera acutorostrata) y canguro rojo (Macropus rufus).

3.1.1 Descargá las secuencias antes mencionadas de la carpeta del TP.
3.1.2 Utilizá la herramienta de alineamiento global de EMBOSS needle (pueden leer el manual para ver que opciones admite) para comparar las tres secuencias.

needle -gapopen 10 -gapextend 1 -asequence *secuencia_1* -bsequence *secuencia_2* -outfile *salida*

3.1.3 Observá e interpretá las salidas obtenidas. ¿Qué secuencias son más similares? ¿Tiene sentido el resultado obtenido?

3.1.4 Analizá árbol filogenético de la Fig. 1 del paper de O'Leary et al., 2013. Sabiendo que los caballos y las ballenas pertenecen al clado Euungulata y los canguros al clado Marsupialia, ubicá estos clado en el árbol. ¿Esta información coincide con los resultados que obtuviste en 3.1.3?

3.2 Realizá el mismo procedimiento pero esta vez para determinar si los mamuts (Mammuthus primigenius) son más cercanos a los elefantes africanos (Loxodonta africana) o asiáticos (Elephas maximus) utilizando la secuencia de la cadena alfa de la hemoglobina.

3.2.1 ¿Qué te sugieren los resultados obtenidos?

3.2.2 ¿Es relevante la diferencia hallada?

3.2.3 ¿Cómo harías para sacar conclusiones más fuertes sobre las relaciones filogenéticas entre los organismos estudiados en los ejercicios 3.1 y 3.2?

Alineamientos múltiples

Un alineamiento múltiple (MSA) involucra tres o más secuencias biológicas. Debido a que la tarea de alinear múltiples secuencias de largos biológicamente significativos suele ser muy demandante en términos de recursos computacionales y tiempos de ejecución estos requieren metodologías más sofisticadas para llevarse a cabo. Por ello la mayoría de los programas disponibles para realizar MSA utiliza heurísticas en vez de algoritmos de optimización global.

Heurística

Es una estrategia que busca resolver un problema más simple cuya solución se interseca con la solución de un problema más complejo. Generalmente esto implica que no es seguro encontrar el mejor resultado pero sí una solución que sea aceptable. Las heurísticas se aplican con frecuencia en computación para poder resolver problemas que, por su complejidad, serían imposibles de abordar dados los limitados recursos con los que se cuentan.

Dadas las secuencias de aminoácidos de un set de proteínas que se quieren comparar, el MSA muestra los residuos de cada proteína en una fila junto con los gaps que le correspondan de tal manera que todos los residuos "equivalentes" se encuentren en la misma columna. La utilidad de esta equivalencia depende de quien mire el alineamiento:

Alguien que hace una filogenia puede enfocarse en que comparten un ancestro común;
Alguien que hace biología estructural puede enfocarse en que son residuos en posiciones análogas de una estructura proteica;
Alguien que hace biología molecular puede enfocarse en el rol funcional de esos residuos en la proteína.

En cada caso un MSA provee un pantallazo sobre las restricciones evolutivas, estructurales o funcionales que caracterizan un set de proteínas de una manera visual e intuitiva.

Un pipeline típico para realizar un MSA sería:

Formular la pregunta que se quiere contestar. Por ejemplo, "¿Qué estructura secundaria adopta X región de mi proteína de interés?"
Obtener secuencias que puedan contestar a mi pregunta. Por ejemplo, secuencias que estén relacionadas a mi proteína de interés.
Utilizar alguno de los programas disponibles para llevar a cabo el MSA. Por ej. EMBOSS
Realizar ajustes manuales para corregir posibles errores de los algoritmos de alineamiento.

Ejercicio 4 (Adicional)

Atención

Antes de comenzar a resolver los ejercicios, instalá ClustalW en tu VM, escribiendo el siguiente comando en la terminal:

sudo apt install clustalw

La gp120 es una proteína que recubre al virus del HIV y facilita su unión e ingreso a la célula que infecta (linfocitos CD4+) Entre nuestros archivos contamos con un multifasta (gp120.fasta) que contiene 27 secuencias de gp120 de HIV-1, HIV-2 y SIV. Estas proteínas contienen 9 puentes disulfuro conservados. También es de interés el loop V3, una porción expuesta de la proteína, conocido target de anticuerpos el cual constituye una región hipervariable dada la presión selectiva a la que se ve sometido.

Pueden ver la disposición de las distintas regiones de la gp120 en el siguiente esquema:

Mathys L, Balzarini J. Several N-Glycans on the HIV Envelope Glycoprotein gp120 Preferentially Locate Near Disulphide Bridges and Are Required for Efficient Infectivity and Virus Transmission. PLoS One. 2015 Jun 29;10(6):e0130621. doi: 10.1371/journal.pone.0130621. PMID: 26121645; PMCID: PMC4488071. Figure 1.

4.1 Utilizá las herramientas de EMBOSS para realizar un alineamiento múltiple con las secuencias de gp120 (recuerden que para buscar herramientas pueden usar wossname)

Pista

El comando a utilizar es emma. Para ver la ayuda, tipeá emma -help en la terminal.

4.2 Utilizá el comando showalign de EMBOSS para obtener una mejor visualización del alineamiento.

Otra alternativa

Para visualizar el alineamiento correctamente le sugerimos usar el comando cat en la consola.
Si desea ver el archivo con Leafpad recuerde ingresar a Opciones > Tipografía y seleccionar Ubuntu Mono.

4.3 Observá el alineamiento, como primer control podemos corroborar que las 18 Cisteínas (C) estén bien alineadas.

4.4 Utilizá el esquema de gp120 para identificar diversas regiones ya sea conservadas o muy variables (Estructuras, loops, etc.)

Tip

Notá que las posiciones en el alineamiento cuentan gaps por lo que no se corresponden exactamente con el esquema. Utilizá las posiciones de las cisteínas conservadas para identificar diferentes regiones.

Ejercicio a informar

Info

Fecha límite de entrega: Viernes, 30 de Agosto 2024, 23:59hs.

Materiales

Enunciado

Usted trabaja en un laboratorio que estudia distintos aspectos del virus del papiloma humano (HPV). Como parte de su colaboración con Servicio Virus Oncogénicos del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, todos los días se obtienen nuevas secuencias de aislamientos de HPV. Recientemente, el servicio compartió con su jefe un nuevo aislamiento del virus, y su jefe le ha encomendado a usted la tarea de analizar dicho aislamiento para extraer toda la información bioinformática posible de su colección de datos.

Breve descripción del virus del papiloma humano

El virus del papiloma humano (VPH o HPV, del inglés human papillomavirus) es el virus responsable de una de las infecciones de transmisión sexual más frecuentes en todo el mundo. Se estima que 4 de cada 5 personas van a contraer uno o varios de los tipos de VPH en algún momento de sus vidas. Existen alrededor de 100 tipos de HPV, de los cuales 40 afectan la zona genital y anal. Los distintos tipos de HPV se clasifican en dos grandes grupos, denominados de alto y bajo riesgo oncogénico. Los HPV de bajo riesgo suelen estar asociados con lesiones benignas o de bajo grado, mientras que las infecciones con HPV de alto riesgo oncogénico pueden evolucionar a cáncer, siendo el cáncer de cuello de útero el más frecuente. Los tipos de HPV de alto riesgo más comunes son el 16 y 18. La determinación del tipo de HPV se realiza con distintas técnicas de biología molecular que permiten identificar diferencias genómicas. Los HPV son grupos diversos de virus ADN pertenecientes a la familia de los Papillomaviridae. Las diferencias entre estos virus a nivel de secuencia de ADN permiten clasificarlos (o genotipificarlos), lo cual resulta muy importante debido a la diferencia de patologías que pueden causar los distintos tipos de HPV.

Trabajo a realizar

Usted cuenta con un conjunto de secuencias que utiliza normalmente en su laboratorio, organizadas de la siguiente manera:

Nombre del archivo	Descripción
all_sequences.fasta	Archivo multifasta con 11 secuencias de distintos tipos de HPV
all_sequences.gb	Archivo GenBank. Almacena las mismas 11 secuencias que el archivo fasta, con información adicional (como anotaciones de proteínas)
conjunto_de_secuencias	Archivo de hoja de cálculo con información sobre la secuencia y el organismo al que pertenece

Pero… Cuando usted recibe los datos (secuencia_incognita.fasta) se da cuenta se da cuenta que el archivo no ha sido nombrado correctamente. Este tipo de errores son comunes debido a la gran cantidad de secuencias que maneja el Servicio Virus Oncogénico, ya que este servicio actúa como Laboratorio Nacional de Referencia del Ministerio de Salud (MSAL) para el virus papiloma humano (HPV) y el virus de Epstein-Barr (EBV).

Para solucionar el problema, decide aplicar las herramientas que aprendió en el trabajo práctico N3 de bioinformática cuando era estudiante y procede a:

Verificar que la secuencia que le mandaron corresponde al virus de HPV y no a otro. Para esto, hay que comparar la secuencia del nuevo aislamiento con alguna secuencia de su conjunto de secuencias. ¿Pertenece el nuevo aislamiento a un HPV?

Tip

Recuerden usar parámetros adecuados de ventana y umbral
Debido a la importancia a nivel diagnóstico, ahora quiere saber qué tipo de HPV es. Para esto decide determinar el % de similitud que posee su secuencia con cada una de las secuencias con las que usted trabaja comúnmente. ¿Puede decir que tipo de virus es en base a la información que posee?

Tip

Si necesitan dividir el archivo All_Sequences.fasta en archivos individuales pueden buscar wossname split.
Ahora comparen el tipo de HPV del aislamiento con otros del mismo riesgo y de distinto nivel de riesgo. ¿Encuentran alguna región que pueda ser útil para genotipificación? ¿Qué eventos observan en los dotplots cuando comparan HPV de igual y de distinto riesgo?

Extra! (y por ende opcional)

Para resolver los puntos 2 y 3 se puede hacer un script de bash tanto para el alineamiento, para ver los % de similitud y para crear dotplots. El parámetro que tienen que agregar a dotmatcher para que el archivo generado sea un pdf de nombre “grafico.pdf” es -graph pdf -goutfile grafico. Si lo logran (o si lo intentan), los invito a incluirlo en el trabajo práctico (aún cuando no les salió).