TP 5. Perfiles de secuencias y PSI-BLAST

Materiales

Atención: Este TP tiene informe.

Construcción de Logos y Matrices peso-específicas

Objetivos

• Familiarizarse con la construcción de matrices peso-específicas o PSSM.
• Familiarizarse con la visualización de logos de secuencias, y el uso del contenido de información.
• Utilizar las matrices peso-específicas como métodos predictivos, y entender las métricas PCC (Pearson correlation coefficient) y Aroc (Area under the Receiver Operating Characteristic curve) empleadas para evaluar la calidad de los modelos.

Introducción

En este TP utilizaremos herramientas bioinformáticas para predecir la unión de péptidos a MHC, o por sus siglas en inglés Major Histocompatibility Complex, y seleccionaremos potenciales epítopes como candidatos para desarrollar una vacuna.

Los pasos a seguir serán:

1. Identificación de motivos de unión a MHC.
2. Visualización de motivos utilizando logos de secuencias.
3. Entrenamiento de métodos de predicción de unión a MHC.
4. Utilización de los métodos desarrollados para la selección de candidatos vacunales.

La unión de péptidos a MHC es el paso más selectivo en el camino de procesamiento y presentación antigénica. Este evento es crucial ya que solamente 1 de cada 200 péptidos forma un complejo con el MHC. Existe una gran variedad de MHC diferentes, cada uno con una alta especificidad.

El motivo de unión de los MHC de la vía de clase I es, en la mayoría de los casos, de 9 aminoácidos de longitud. Estos están caracterizados por una marcada preferencia por ciertos aminoácidos en determinadas posiciones del motivo. Estas posiciones son llamadas "anclas" o, en inglés, anchor positions. Para una gran cantidad de complejos de MHC de clase I estas anclas se encuentran en las posiciones P2 y P9. Sin embargo, este no es siempre el caso.

Existe una gran cantidad de datos que describen las diferentes especificidades de las moléculas de MHC. Una base de datos muy conocida que almacena esta información es SYFPEITHI. En ella se puede encontrar informacion de ligandos y motivos de MHC.

Con este tipo de información es posible desarrollar un modelo de predicción de unión de péptidos a MHC y usarlo para descubrir nuevos epítopes con los cuales diseñar vacunas. Esto puede ser aplicado a nivel de proteomas enteros para ahorrar tanto tiempo como recursos.

A continuación vamos a:

1. Visualizar motivos de unión utilizando logos de secuencias.
2. Entrenar un modelo predictivo utilizando el servidor de EasyPred.
3. Aplicar el modelo para seleccionar péptidos con potencial inmunogénico de proteínas de SARS-CoV-2.

Identificación de motivos de unión a MHC

Diríjanse a la página web de SYFPEITHI. Allí, una vez que hagan click en el logo, pueden buscar motivos con el botón Find your motif, Ligand or Epitope.

Allí seleccionen con el menú de la izquierda el alelo de MHC HLA-A*02:01 y presionen Do Query.

Nota

El resto de las opciones se pueden usar para refinar la búsqueda, limitándola a ligandos de proteínas determinadas o por referencia bibliográfica. En este caso queremos obtener TODOS los ligandos para poder ver qué características comparten.

En el resultado de la búsqueda podemos ver las posiciones anchor principales y auxiliares, y también otras posiciones con residuos preferidos. También tenemos una lista de otros aminoácidos que se ven con frecuencia en los ligandos del alelo que estamos estudiando. Por último, más abajo, se muestra la lista de los ligandos que existen en esta base de datos, junto a su proteina de procedencia, la referencia del trabajo donde se lo identificó y alguna nota como la asociación de un péptido dado con una enfermedad.

1. Respondan a las siguientes preguntas :

a. ¿Qué posiciones identifican como anchors? ¿Qué residuos son preferidos en estas posiciones? ¿Y en los auxiliary anchors?

b. ¿Qué otras posiciones muestran preferencias de residuos? ¿Qué residuos son preferidos en estas posiciones?

c. ¿Qué diferencia observa para las posiciones anchor en el conjunto de péptidos en comparación al resto de las posiciones? Recuérdenla para el ejercicio de logos de secuencia.

2. Repitan el mismo análisis para el alelo HLA-B*27. ¿Coinciden las posiciones anchor con las del alelo HLA-A*02:01?, ¿y los residuos preferidos?

Logos de secuencias

Los logos son una herramienta muy útil para visualizar motivos de unión. En un logo de secuencia se grafica en el eje y el contenido de información de cada posición del motivo, generalmente expresado en bits. A su vez, la frecuencia con la que aparece una letra (nucleótido u amininoácido) en una dada posición se grafica con un tamaño proporcional a dicha magnitud.

Un servidor que nos permite generar facilmente logos de secuencia es Seq2Logo. Este método nos da la opción de ingresar un alineamiento múltiple (MSA), una lista de péptidos o una matriz peso-específica con la cual realizar el gráfico.

La información puede pegarse directamente en el cuadro de texto que provee la web, o subiendo directamente un archivo local utilizando la opción Switch to file upload que se encuentra debajo del cuadro.

Dentro de las opciones que nos permite cambiar tenemos:

• Logo type: Esto refiere a la magnitud que se calculará para cada posición y se graficará en el eje y (Kullback-Leiber, Shannon, etc.).
• Clustering method: Agrupa las secuencias que son muy similares para no sesgar el resultado, se pueden optar por diferentes métodos.
• Weight on prior: Es el valor que le asignamos al parámetro beta en la ecuacion del cálculo del contenido de información. Recuerden que la relación entre alfa y beta es determinante para este cálculo.
• Information content units: Generalmente se expresa en bits, pero en algunos casos se opta por half-bits.
• Output format: El tipo de archivo de imagen adonde se guardará el logo.

También tenemos la opción de realizar cambios avanzados, como modificar las frecuencias de background o la matriz de scoring, limitar la región del alineamiento que queremos graficar, etc. y opciones gráficas, como el tamaño de la imagen y los colores con los que se representa cada aminoácido.

Por convención los colores que se utilizan son:

• Rojo: Aminoácidos ácidos [DE]
• Azul: Aminoácidos básicos [HKR]
• Negro: Aminoácidos hidrofóbicos [ACFILMPVW]
• Verde: Aminoácidos polares y glicina [GNQSTY]

Atención

Recuerden guardar los logos de secuencia generados.

3. En Materiales pueden encontrar los archivos HLA-A0201 y HLA-B27, los cuales contienen ligandos de cada uno de estos alelos de MHC. Úsenlos para generar logos que muestren sus motivos de preferencia. Utilicen como opción de clustering Heuristics.

Usamos para el resto de las opciones los valores default. Identifiquen las posiciones ancla y las preferencias de cada alelo.

a. ¿El logo obtenido para HLA-A02:01 y HLA-B27 se condice con lo que encontró en la base de datos en el punto anterior?

b. ¿Qué magnitud es la que está diferenciando a las posiciones anchor del resto? ¿En qué unidad aparece representada en el logo? ¿Coincide con lo supuesto en el punto 1.c?

Construcción de matrices peso-específicas (PSSM)

Para este punto vamos a utilizar el servidor de EasyPred. Esta herramienta nos permite construir tanto matrices peso-específicas, o PSSM (Position-Specific Scoring Matrix), como aplicarlas a un set de datos para calcular su score.

El servidor consta de dos cuadros de texto, el de la izquierda en el cual se ingresan datos para construir la matriz, y el de la derecha donde uno puede ingresar secuencias sobre las cuales quiere realizar una predicción.

Para explorar un poco la construcción de matrices solo utilizaremos el recuadro de la izquierda donde ingresaremos las siguientes secuencias:

VFAAA  
VHYWW  
VLQPK  
LREWQ  
LPYIH  

Las opciones que tenemos aquí son muy similares a las que habiamos visto en el servidor de Seq2Logo debido a que ambos realizan cálculos del contenido de información.
En este caso vamos a seleccionar Clustering method: No clustering y Weight on prior: 10000. Usamos para el resto de las opciones los valores default.

4. Antes de generar la PSSM, reflexionen un poco acerca de los parámetros empleados para la construcción de la misma.

a. ¿Por qué consideran que no estamos usando ningún método de clustering?

b. ¿Por qué creen que es tan alto el valor sugerido para el weight on prior (β) ?

Recordatorio

La ecuación utilizada para estimar la frecuencia p_a, para una dada posición, en una matriz peso-específica es,

donde α es el número de secuencias en el MSA-1, β es el weight on prior o weight on pseudocounts, f_a es la frecuencia observada para el aminoácido a en esa posición y g_a es la pseudo frecuencia para el aminoácido a en esa misma posición.

Hagan Submit query y observen la salida. Allí podrán encontrar información sobre los parámetros utilizados y un logo que representa el set de datos que ingresamos.

Observando el logo generado:

5. ¿Qué aminoácidos es más probable hallar en la posición P1?

Pista

Son los que están por encima de y=0.

6. ¿Cuántos aminoácidos diferentes hay en P1 (en y>=0)? ¿Cuáles se encuentran datos de entrada? ¿Cuáles en el logo generado?

7. ¿A qué se debe esta diferencia?

8. Realice el mismo ejercicio pero ahora elija un weight on prior β=0. ¿Cambian sus respuestas para los puntos 5., 6. y 7.?

Predicción de unión a MHC

Habiéndonos familiarizado con la interfaz de EasyPred vamos a utilizarla para entrenar un modelo con más datos y ponerlo a prueba. Para eso utilizaremos dos sets de entrenamiento que poseen péptidos fueron testeados con el alelo HLA-A02:01. Cada uno tiene un valor asociado que denota si son positivos (1) o negativos (0.1). A lo largo del proceso iremos variando diferentes parámetros para observar qué efectos esto tiene sobre el poder predictivo del modelo, al ser testeado en un set de evaluación con valores de afinidad (binding affinity) de unión a MHC reales (reescalados entre 0 y 1).

Los datos que utilizaremos están en los archivos:

• Entrenamiento_chico.set que contiene 110 péptidos de los cuales sólo 10 son positivos.
• Entrenamiento_grande.set contiene 232 péptidos de los cuales todos son positivos.

Para evaluar el desempeño de nuestro modelo utilizaremos el archivo Evaluacion.set, el cual contiene 1266 peptidos con valores de afinidad convertidos al rango 0-1 mediante la formula 1-log(x)/log(50000). Utilizando esta transformación,

• valores mayores a 0.638 (equivalente a 50nM) representan una unión fuerte,
• entre 0.638 y 0.426 (equivalente a 500nM) una unión débil
• y péptidos con valores menores a 0.426 no se consideran ligandos.

Atención

Una buena práctica antes de comezar a hacer cualquier cosa con nuestros datos es observarlos y entender el formato en el que están almacenados.

Por ejemplo, si hacemos un cat del archivo Entrenamiento_chico.set (si están con la VM o bien pueden abrir el archivo con el "Block de notas" haciendo click derecho sobre el archivo y Abrir con... elegir el block de notas entre las opciones), nos encontramos con lo siguiente:

Este es un archivo con dos columnas, la primera contiene a los péptidos y la segunda a los valores de afinidad de unión o binding affinity de los mismos. (¿En qué escala están los valores de binding affinity? ¿Están normalizados entre 0 y 1?)

Para analizar el desempeño de nuestros modelos vamos a tener en cuenta dos métricas:

• Aroc (Area under the Receiver Operator Curve): este valor varía entre 0 y 1, siendo 1 el puntaje perfecto y 0.5 el valor aleatorio. Por regla general, valores mayores a 0.85 son altamente deseables.
• Coeficiente de correlación de Pearson (PCC): también oscila entre 0 y 1, siendo 1 una correlación perfecta entre las dos variables de estudio, y -1 una anticorrelación perfecta. En este caso el valor que implica aleatoriedad total o no correlación entre las dos variables es 0.

Estas métricas nos van a ayudar a seleccionar el mejor de nuestros modelos, siendo éste el que alcance los mejores valores de Aroc y Coeficiente de Pearson.

Note

A continuación vamos a entrenar varios modelos y comparar sus resultados. Haga cada prueba en una ventana nueva o guarde las salidas de alguna manera que crea conveniente.

Primera prueba

Atención

Volvamos a abrir EasyPred o recarguemos la página para que todas las opciones vuelvan a estar por defecto.

Realicemos los siguientes cambios: los datos del archivo Entrenamiento_chico.set en el recuadro de entrenamiento y los de Evaluacion.set en el recuadro de evaluación. Coloquemos el umbral de corte para positivos (Cutoff for counting an example as a positive example) en 0 y apretemos el botón Submit query.

La salida consta de varias partes:

• Al principio tenemos una pequeña descripción de los parámetros con los que se llevó a cabo el entrenamiento, tanto de los datos como del método. Esto es siempre útil para poder reproducir los resultados.
• Luego tenemos un logo construído a partir de los datos de entrenamiento. Esto nos puede ayudar a identificar (como hicimos anteriormente) la preferencia de la molécula que se une a nuestro set de péptidos.
• A continuación sigue la información sobre la evaluación. Allí podemos encontrar los valores del coeficiente de Pearson y Aroc y la lista de predicciones sobre el set de evaluación. Fíjense que Assignment se refiere al valor medido o real que está en el archivo de evaluación y va de 0 a 1, sin embargo la predicción puede adoptar otros valores, incluso negativos.

Tip

Las métricas que utilizamos no se enfocan en reportar la precisión del método (proporción de verdaderos positivos entre todos los péptidos predichos como positivos) sino que muestran:

1. la habilidad del método para distinguir instancias positivas de negativas (Aroc) y

2. la correlación entre los valores predichos y los valores reales u observados (PCC).

Revisando la salida contesten:

9. ¿Qué valores de Aroc y PCC obtuvieron? ¿Qué implica esto?

10. Viendo el logo resultante, ¿Entienden por qué el modelo tiene tan mal desempeño?

11. ¿Cuántos de los 110 péptidos se utilizaron para la construcción de la matriz? ¿Por qué se usó ese número de péptidos?

Pista

Mire el archivo de entrada Entrenamiento_chico.set y vea cuáles son los valores de afinidad para los péptidos allí listados.

Segunda prueba

Volvamos a la página principal de EasyPred. Esta vez coloquemos el umbral de positivos en 0.5 pero especifiquemos que no haya clustering y pongamos un weight on prior de 0.0.

12. ¿Qué valores de desempeño tienen ahora? ¿Qué implican estos valores? ¿Son mejores o peores que en la primera prueba? ¿Por qué cree que cambiaron?

13. ¿Cuántos de los 110 péptidos se utilizaron en este caso para la construcción de la matriz?

14. Mirando el logo, ¿Se parece al motivo de unión de HLA-A*02:01 que habían visto antes? ¿Por qué cree que ocurre esto?

Pista

Tenga en cuenta el número de secuencias que se usaron para construir la matriz y recuerde que siempre es una buena práctica revisar las instrucciones de la guía y los archivos de entrada.

Tercera prueba

Volvamos atrás y repitamos el caso anterior pero seleccionando Clustering at 62% identity. Mantengamos el weight on prior en 0.0 y el resto de los parámetros como se habían seteado en la segunda prueba.

15. ¿Cuál es el desempeño ahora?

16. ¿Cambió el logo con respecto al anterior? Si es así… ¿A qué cree que se debe el cambio?

Pista

De nuevo, es una buena práctica revisar qué contienen los archivos de entrada, es decir los datos crudos. Miren con atención las secuencias de los positivos.

Cuarta prueba

Volvamos una vez más, manteniendo Clustering at 62% identity pero utilicemos como weight on prior un valor de 200, y el umbral de positivos en 0.5.

17. Una vez más revisen las métricas de desempeño.

18. Mirando el logo, ¿Cuál es la gran diferencia con aquellos que venían viendo? ¿Cuál es la razón de este cambio? ¿Empieza ahora a parecerse a los motivos que habían visto antes?

Quinta (y última) prueba

Hasta ahora veníamos utilizando un set de datos sumamente reducido, con solo 10 péptidos positivos para entrenar. Aún asi hemos conseguido valores de desempeño bastante aceptables. Sin embargo, estos métodos suelen utilizar muchas más información para su entrenamiento.

A continuación recarguen la página de EasyPred y carguen para entrenar el archivo Entrenamiento_grande.set. En el cuadro de evaluación vuelvan a cargar Evaluacion.set. Seleccionen una vez más Clustering at 62% identity, pongan el weight on prior en 200 y el umbral de positivos en 0.5. Tilden también la opción Sort output on predicted values para ver la tabla de péptidos ordenada por los valores de predicción.

19. Revisen una vez más los valores de desempeño.

20. Vean el logo, ¿qué les parece?

21. Mirando la tabla de predicciones, ¿Cuántos falsos positivos encuentran entre los primeros 20 péptidos? (con Assignment menor a 0.426)

Atención

Antes de cerrar la ventana haga click en Parameters for prediction method luego del logo. Allí podrá descargar la matriz calculada a partir de los datos de entrenamiento (Se descarga con el nombre para.dat, es un archivo de texto plano). Esta puede ser utilizada luego para llevar a cabo predicciones.

PSI-BLAST

Objetivos

• Comprender el funcionamiento del algoritmo PSI-BLAST, aplicando el mismo en un caso de estudio en el que BLAST no funciona.
• Generar y reutilizar la PSSM que arroja PSI-BLAST, para encontrar hits en otras bases de datos relevantes tales como PDB.
• Entender la información que nos otorga la PSSM construída por PSI-BLAST en relación a los residuos o dominios conservados de una proteína.

Introducción

PSI-BLAST (o Position Specific Iterated BLAST) es un algoritmo alternativo de BLAST que construye iterativamente una matriz de puntajes posición específica, o PSSM (Position-Specific Scoring Matrix), para calcular el score de los alineamientos.

En su forma básica de funcionamiento lo que hace es realizar un simple BLAST con una secuencia query y, a partir de los resultados o hits que obtiene, construye un perfil o PSSM. Entonces, la siguiente búsqueda la realiza con ese perfil, lo que permitirá encontrar, idealmente, nuevos hits, correspondientes a secuencias más distantes de la secuencia query. Con esos nuevos hits genera un nuevo perfil, el cual, idealmente, contendrá mayor cantidad de información y con el que se podrá realizar otra búsqueda. Es un proceso iterativo.

En resumen, a partir de la segunda iteración los puntajes de la matriz variarán acorde a la conservación de los aminoácidos o nucleótidos en cada posición permitiendo refinar nuestra búsqueda y así recuperando secuencias distantes que comparten motivos o dominios con nuestra secuencia query original.

Cuando BLAST falla

Digamos que se tiene una secuencia query (abajo) y se quiere predecir su estructura y función. Como vimos anteriormente uno recurre generalmente a BLAST para este tipo de tareas. Si logramos identificar una proteína suficientemente similar podríamos hipotetizar que comparten dichas caracteristicas.

>QUERY1
MKDTDLSTLLSIIRLTELKESKRNALLSLIFQLSVAYFIALVIVSRFVRYVNYITYNNLV
EFIIVLSLIMLIIVTDIFIKKYISKFSNILLETLNLKINSDNNFRREIINASKNHNDKNK
LYDLINKTFEKDNIEIKQLGLFIISSVINNFAYIILLSIGFILLNEVYSNLFSSRYTTIS
IFTLIVSYMLFIRNKIISSEEEEQIEYEKVATSYISSLINRILNTKFTENTTTIGQDKQL
YDSFKTPKIQYGAKVPVKLEEIKEVAKNIEHIPSKAYFVLLAESGLRPGELLNVSIENID
LKARIIWINKETQTKRAYFSFFSRKTAEFLEKVYLPAREEFIRANEKNIAKLAAANENQE
IDLEKWKAKLFPYKDDVLRRKIYEAMDRALGKRFELYALRRHFATYMQLKKVPPLAINIL
QGRVGPNEFRILKENYTVFTIEDLRKLYDEAGLVVLE

Vayan a la pagina de BLAST y utilicen el algoritmo de Protein BLAST para buscar secuencias similares. En el campo de base de datos seleccione pdb que es la base que contiene estructuras.

Tip

Pueden correr la búsqueda eligiendo el parámetro "Show results in a new window".

1. ¿Cuántos hits con E-value < 0.05 encuentran? Vuelvan atrás y, en Program selection: Algorithm, seleccionen PSI-BLAST. ¿Cambió el resultado en comparación a lo que habían obtenido anteriormente?

Usando PSI-BLAST

Atención

Realicen cada corrida de BLAST (e iteración de PSI-BLAST) en una ventana diferente, en varios casos van a necesitar comparar las salidas.

Vuelvan atrás a la página de alineamiento de proteínas, pero esta vez seleccionen la base de datos Non-redundant protein sequences (nr) y en la sección de algoritmos seleccionen PSI-BLAST.

Teniendo en cuenta que el primer hit es nuestro query y por lo tanto vamos a ignorarlo:

2. Ahora, ¿Cuántos hits significativos encuentran (E-value < 0.005)?

3. ¿Qué significa la variable Query Cover? Una manera visual para entender el query coverage es mirar el Graphic Summary. Dentro de la pestaña Descriptions, coloquen la pestaña Show en 100. Luego cliqueen en la pestaña Graphic Summary. ¿Cuál es la cobertura de los hits obtenidos?

Construyendo la PSSM

Si se fijan debajo de los hits significativos van a tener la opción de seguir iterando PSI-BLAST:

Allí pueden especificar cuantas secuencias queremos utilizar para refinar nuestras PSSM (Position-Specific Scoring Matrix). Conservando el valor por defecto corramos la siguiente iteración.

4. ¿Cuántos hits significativos pueden encontrar ahora (E-value < 0.005)?

5. ¿Cómo se modificó el coverage de estos hits? Vuelvan a mirar el Graphic Summary, colocando previamente en Descriptions la pestaña Show en 250.

6. ¿Por qué creen que PSI-BLAST puede identificar ahora más hits significativos y que es lo que está afectando el query coverage?

7. ¿Qué significan que los hits estén resaltados en amarillo, y qué significa que estén en blanco con un tick verde?

Nota

Antes de proseguir realicen una o dos iteraciones más y observen la aparición de nuevas proteínas identificadas (marcadas con amarillo).

Guardando y reutilizando la PSSM

Ahora podemos utilizar la PSSM que está ajustada con los resultados obtenidos de PSI-BLAST para realizar búsquedas más significativas en otras bases de datos. Para obtener la PSSM descarguenla arriba donde dice "Donwload All"

Volvamos una vez más a la página para realizar la búsqueda. Sin ingresar ninguna secuencia query seleccionemos otra vez la base de datos de estructuras Protein Data Bank (pdb) y como algoritmo PSI-BLAST. Por último, justo debajo del botón de BLAST, abramos el menú de Algorithm parameters y carguemos nuestra PSSM (justo al final). Ahora sí corramos la búsqueda.

8. ¿Pueden encontrar hits significativos de PDB ahora?

9. ¿Qué función pueden identificar en los primeros hits?

Identificando residuos conservados

Ahora (si tuvimos suerte) habremos podido identificar una relación estructural entre nuestra secuencia query y las secuencias de la base de datos de estructuras proteicas PDB. Digamos que, en este punto, nos gustaría validar esa relación.

Para identificar los residuos conservados en nuestra secuencia query vayan al servidor de Blast2logo y suban dicha secuencia. Seleccionen BLAST Database NR70 y denle Submit (esto puede llevar un tiempito). En caso de que algo falle puede encontrar la salida acá.

Cuando esto termine deberían tener un logo de toda la secuencia.

Atención

Si les resulta difícil de leer pueden hacer click en el botón Customize visualization using Seq2Logo. Al hacer esto los transfiere al servidor de Seq2logo y allí, sin tocar ninguna opción, denle Submit.

Arriba les va a aparecer la opción de descargar cada imagen por separado (JPEG(1), JPEG(2), etc.) o en un sólo archivo EPS (similar a PDF). Se recomienda esto último.

10. Viendo el logo: ¿Por qué creen que las primeras ~150 posiciones se ven bastante planas (Bits<1)? ¿Cuáles son las posiciones con contenido de información más alto? ¿Pueden identificar el dominio conservado que habían visto en el ejercicio anterior?

Para probar qué residuos dentro del dominio más conservado son los más relevantes para la estructura y/o función de nuestra proteína, podríamos realizar un ensayo de mutagénesis en el laboratorio. Debido a que la secuencia de nuestra proteína es larga (más de 400 aminoácidos), un estudio completo de mutagénesis podría resultar extremadamente costoso.

Por esta razón, teniendo en cuenta lo realizado con el servidor Blast2logo, vamos a seleccionar (guiados por la conservación de los residuos) 4 de los siguientes 8 residuos para llevar a cabo nuestro hipotético ensayo de mutagénesis:

• (a): H271
• (b): R287
• ©: E290
• (d): Y334
• (e): F371
• (f): R379
• (g): R400
• (h): Y436

11. ¿Cuáles creen que son los 4 residuos que podríamos mutar de la lista para generar un impacto en la estructura de nuestra proteína query?

Ejercicio a informar

Info

Fecha límite de entrega: Viernes, 20 de Septiembre 2023, 23:59hs.

Materiales para el Informe

Enunciado

Su jefe leyó el siguiente paper acerca de la respuesta inmune de células T CD8+ en pacientes infectados con COVID-19 y está muy interesado en realizar un estudio preliminar in silico, por lo cual lo convoca a usted que es un experto en Inmuno-bioinformática.

Ferretti, Andrew P et al. “Unbiased Screens Show CD8 + T Cells of COVID-19 Patients Recognize Shared Epitopes in SARS-CoV-2 that Largely Reside outside the Spike Protein.” Immunity vol. 53,5 (2020): 1095-1107.e3. doi:10.1016/j.immuni.2020.10.006

En años anteriores, colegas de su mismo grupo de investigación ya habían realizado estudios bioinformáticos acerca de qué ligandos del alelo HLA-A*02:01 se encuentran en las proteínas del SARS-CoV-2.

En ese momento, su jefe había decidido trabajar con las proteínas S (spike o proteína de glicoproteína de superficie), E (proteína de la envoltura), M (proteína de membrana) y N (fosfoproteína de la nucleocápside) del SARS-CoV-2 ya que creía que eran las que contenían una mayor cantidad de péptidos inmunogénicos. (Puede encontrar una descripción de coronavirus y sus proteínas en ViralZone de Expasy.)

A la luz de los nuevos hallazgos, le propone a usted que trabaje con la proteína ORF1ab (NCBI: YP_009724389.1) de la cual se originan ~50% de todos péptidos inmunogénicos identificados en el estudio de Ferretti et al., 2020.

Para comenzar, se le ocurre realizar predicciones utilizando la matriz peso-específica del alelo HLA-A*02:01 que ya había generado en un curso de Bioinformática tiempo atrás y que sabe que funciona muy bien.

Decide además utilizar la herramienta EasyPred que ya usó previamente para generar su matriz peso-específica, pero esta vez la usará para realizar una predicción. Por lo tanto, deja el recuadro de entrenamiento vacío e ingresa el archivo con la secuencia de la proteína a evaluar en el recuadro de evaluación. Por último, sube el archivo con la matriz en la sección Load saved prediction method.

Selecciona Sort output on predicted values y aprieta el botón Submit query.

Atención

Importante: En la salida no hay logos ni métricas porque ya no se está entrenando ni testeando el modelo. En este punto se está utilizando un modelo ya entrenado (su matriz) para hacer predicciones en datos que nunca vio. La lista de péptidos son todas aquellas secuencias de 9 aminoácidos que se pueden obtener de la secuencia proteica que se le administra al servidor, junto con el valor de predicción.

1. Describa lo que observa en el output de EasyPred. ¿Qué operación realiza el servidor para obtener las predicciones para cada péptido?

2. Realice un histograma que ilustre la distribución de los valores de predicción obtenidos para todos los péptidos. ¿Qué característica posee esta distribución?

3. Elija las secuencias con valores de predicción mayores 8 y luego seleccione otro conjunto de secuencias con valores de predicción entre 2 y 3. Realice logos para ambos conjuntos de secuencias. Para realizar los logos, utilice Seq2Logo y genere logos con los péptidos seleccionados ajustando los parámetros según su criterio.

Atención

Importante: Seq2Logo toma como máximo 50 secuencias para construir el logo!

Extra (y por ende opcional)

4. En base a los conocimientos adquiridos en su curso de Bioinformática, ¿en qué difieren ambos logos? ¿Esto es esperable? ¿Cuál de los logos se parece más al motivo hallado para el alelo HLA-A*02:01? ¿Puede ver claramente las posiciones ancla? ¿Qué aminoácidos son los preferidos para estas posiciones?

5. En la Tabla 1 del paper de Ferretti et al., 2020, se listan 29 péptidos que han resultado inmunogénicos al ser testeados con células T CD8+ de memoria de pacientes de COVID-19 con el mismo MHC (o HLA). Para la proteína no-estructural ORF1ab y el alelo HLA-A*02:01, se identificaron 3 péptidos inmunogénicos compartidos entre pacientes. ¿Qué valores de predicción obtuvo para los mismos con su PSSM? ¿Hay alguno de estos péptidos que no predijo? ¿Por qué? Comente al respecto.

Material extra para practicar

• Handout 1: The Psi-Blast alignment scoring matrix

• Handout 2: Estimation of pseudo counts

• Resolución del ejercicio Estimation of pseudo counts