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TP 11. Motivos lineales




Slides mostrados en la clase

Atención: Este TP tiene informe.

Materiales

Recursos Online

Objetivos

  • Familiarizarse con la simbología utilizada en expresiones regulares
  • Utilizar la simbología para poder realizar búsquedas basadas en texto

Introducción

La simbología comúnmente utilizada en expresiones regulares es:

Símbolo Definición
. Cualquier aminoácido es permitido
[XY] Solo los aminoácidos X e Y son permitidos
[^XY] Los aminoácidos X e Y están prohibidos
{min,max} Número mínimo y máximo de veces que se puede repetir una posición
^X El aminoácido X se encuentra en el extremo N-terminal
X$ El aminoácido X se encuentra en el extremo C-terminal
(AB)|(CD) Se encuentran, o bien, los aminoácidos AB, o bien, los aminoácidos CD

Estos símbolos nos permiten definir patrones que son observados en proteínas naturales para luego identificarlos en otras proteínas y ser puestos a prueba experimentalmente.

Ejercicios

Ejercicio 1. Familiarizándonos con las Expresiones Regulares

Los receptores nucleares interactúan con diversas proteínas mediantes un motivo lineal llamado NRBox (Nuclear Receptor Box) (Heery,1997). Existen numerosas estructuras de péptidos unidos a diferentes receptores nucleares (PDBs: 3CS8, 2GPO, 1GWQ, 1RJK, 1M2Z) que permitieron estudiar y entender algunas características de la interacción.

La evidencia experimental recolectada de la literatura indica que:

  • El motivo NRBox forma una hélice alfa

  • Existen tres leucinas que se encuentran en una misma cara de la hélice que interactúan con un bolsillo hidrofóbico en la superficie del receptor nuclear (Figura 1).

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Figura 1. Fragmento de la proteína PGC-1 alfa unido al receptor nuclear PPAR-gamma. Se muestra en naranja el backbone de la proteína representado en Cartoon y en azul las tres leucinas que median la interacción representadas en Sticks (PDB:3CS8) y que conforman el motivo NRBox.








Los siguientes fragmentos de secuencia corresponden a regiones de distintas proteínas que interactúan con diversos receptores nucleares y cuya interacción se verificó de manera experimental por distintos métodos.

>sp|Q15648|MED1_HUMAN|644-650
SMAGNTKNHPMLMNLLKDNPAQDFSTL
>sp|O43593|HAIR_HUMAN|565-571
AKHLLSGLGDRLCRLLRREREALAWAQ
>sp|Q16881-4|TRXR1_HUMAN|46-52
GPTLKAYQEGRLQKLLKMNGPEDLPKS
>sp|P48552|NRIP1_HUMAN|500-506
DVHQDSIVLTYLEGLLMHQAAGGSGTA
>sp|Q9UQ80|PA2G4_HUMAN|353-359
YKSEMEVQDAELKALLQSSASRKTQKK 
>sp|Q90ZL7|Q90ZL7_DANRE|69-75
VQHADGEKSNVLRKLLKRANSYEDAVM
>sp|Q9UBK2|PRGC1_HUMAN|143-149
PPPQEAEEPSLLKKLLLAPANTQLSYN 
>sp|Q9JL19|NCOA6_MOUSE|1494-1500
MSPAMREAPTSLSQLLDNSGAPNVTIK
>sp|Q15596|NCOA2_HUMAN|689-695
HGTSLKEKHKILHRLLQDSSSPVDLAK
>sp|Q92793|CBP_HUMAN|69-75
LVPDAASKHKQLSELLRGGSGSSINPG

1. Copie y pegue las secuencias en el recuadro de Test String en regex101 https://regex101.com y pruebe encontrar una expresión regular que permita identificar el motivo que media la interacción de estas proteínas con los receptores nucleares y que cumpla con la evidencia experimental observada.

Regex101

No es una herramienta que se use en bioinformática. Simplemente es un recurso educativo para entender Expresiones Regulares.

En R hay funciones como grep o gregexpr que permiten identificar expresiones regulares y en python hay todo una librería re dedicada a expresiones regulares.

2. Considerando que el motivo se encuentra en una hélice, ¿modificaría la expresión regular que obtuvo?

Ejercicio 2. Base de datos de motivos lineales en Eucariotas (ELMdb)

La base de datos ELM (Eukaryotic Linear Motifs) es una base de datos que se enfoca principalmente en la anotación y detección de motivos lineales (MLs). Para ello cuenta con un repositorio de motivos manualmente anotados, por lo cual está altamente curada y también cuenta con una herramienta de predicción de motivos. Esta predicción de motivos se realiza mediante una búsqueda de patrones de secuencia basada en texto utilizando expresiones regulares.

Las instancias anotadas (es decir, probadas experimentalmente) pueden ser:

  • True Positives: Una instancia anotada con evidencia experimental que demuestra que es funcional.
  • False Positives: Una instancia anotada con evidencia experimental que sugiere que es funcional. Pero luego de una inspección cuidadosa de los anotadores se cree que la instancia en realidad no es funcional.
  • True Negative: Una instancia anotada donde los experimentos muestren que es no funcional.
  • Unknown: No se encontró evidencia suficiente para determinar si la instancia es funcional o no.

1. Busque en ELMdb en la pestaña Prediction la proteína PGC-1-alpha, una de las proteínas de la lista que usamos en el Ejercicio 1, utilizando el accession number o uniprot ID (Q9UBK2 - PRGC1_HUMAN).

Para cada motivo encontrado, se indica con símbolos (descriptos en la parte superior de la página) si la instancia del motivo es predicha o fue identificada experimentalmente (anotadas o "True Positives"). Responda:

  • ¿Encuentra el motivo NRBox entre los True positives?
  • ¿Cuántas instancias True Positive existen para esta proteína?
  • ¿Cómo es la estructura de la proteína donde se encuentran estos motivos?

2. Pegue y copie la siguiente secuencia en ELM y utilice los parámetros que se indican a continuación.

>P53_HUMAN
MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDI  
EQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQ  
KTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDST  
PPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGN  
LRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRP  
ILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELP  
PGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALEL  
KDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD

Asegúrese que los valores de los distintos parámetros son los siguientes:

Cell Compartment: Not specified

Motif Probability Cutoff: 100

Taxonomic context: (leave blank)

  • ¿Cuántas instancias predichas de motivos se encuentran? Para verlo investigue la tabla llamada Filtering Summary. ¿Cuántas son retenidas luego del filtro?
  • ¿Qué se puede decir sobre la estructura de la proteína? ¿Se observa algún dominio? ¿Se observan regiones desordenadas?
  • ¿Los predictores estructurales y filtros (SMART, GlobPlot, IUPRED, Secondary Structure) coinciden sobre qué regiones son estructuradas/desordenadas?

3. Filtrado por compartimento celular

  • ELM nos permite fitrar por compartimento celular ¿Porqué consideran que esto sería útil?

Utilizando el uniprot ID de p53 (P53_HUMAN) busque en la web de Uniprot (https://www.uniprot.org/) las posibles localizaciones subcelulares de esta proteína y utilícelas como filtro en ELM. Para esto:

Realice de nuevo la predicción, ahora asignando en Cell compartment los compartimentos correspondientes utilizando Ctrl para seleccionar más de uno.

  • Realice la predicción y conteste: ¿Cuántas instancias de motivos se encuentran ahora? ¿Cuántas instancias de motivos son retenidas luego del filtro? ¿A qué se debe esta diferencia con el punto anterior?

  • Investigue el motivo CLV_PCSK_FUR_1 en la predicción realizada sólo con la secuencia. ¿Por qué cree que fue filtrado?

  • ¿Cuántas instancias anotadas como true positive posee esta proteína? Compare la ubicación de las instancias anotadas con la información estructural proveniente de IUPred.

  • ¿Cuántas instancias de la clase MOD_CK1_1 se encontraron? ¿Cuál es la diferencia entre estas instancias?

  • ¿Cuántos degrons anotados hay en p53? ¿Cuál es la función de estos motivos?

  • ¿Existe algún sitio anotado CDK (Cyclin Dependent Kinase) en p53?

  • ¿Existe algún sitio anotado DOC_CYCLIN_RXL_1? ¿Qué relación funcional existe entre este sitio y el sitio CDK?

4. Abra una nueva pestaña y vaya de nuevo a la pestaña de predicción. Manteniendo los compartimentos celulares seleccionados para p53, ingrese el Uniprot ID (P53_HUMAN) y modifique el parámetro:

Motif Probability Cutoff: 0.01 (Recuerde que en el punto anterior este parámetro era de 100)

  • ¿Cuántas instancias predichas de motivos se encuentran ahora? ¿Cuántas instancias de motivos son retenidas luego del filtro?

  • ¿Por qué cree que es útil usar el umbral de probabilidad del motivo?

5. Abra una nueva pestaña y vaya de nuevo a la pestaña de predicción. Manteniendo los compartimentos celulares seleccionados para p53, ingrese el Uniprot ID (P53_HUMAN) y modifique el parámetro:

Taxonomic Context: Homo sapiens

  • ¿Cuántas instancias predichas de motivos se encuentran ahora? ¿Cuántas instancias de motivos son retenidas luego del filtro?

  • ¿Por qué cree que es útil usar el contexto taxonómico?

5. Busque la proteína P53_MOUSE en ELM.

  • ¿Existen instancias anotadas?
  • ¿Existen instancias asignadas por homología? ¿A qué organismo pertenecen?

Ejercicio 3. Identificación de motivos cortos de interacción en p53 en un alineamiento propio.

La región amino terminal de p53 posee un motivo de unión a la E3 ligasa MDM2, el cual está caracterizado por una secuencia conservada que puede representarse por una expresión regular.

  1. Entre en la base de datos ELM y busque la expresión regular del motivo con el ID: DEG_MDM2_SWIB_1. Para esto ingrese el ID en la parte superior derecha donde dice: Search ELM database. La expresión regular se encuentra marcada como "Pattern". A continuación, busque las ocurrencias de esta expresión regular en las secuencias de p53. Para ello, abra en Jalview el alineamiento de p53 con el cuál estuvo trabajando en la clase de TP N°7 - Predicción de desorden. Jalview permite la búsqueda de motivos por expresiones regulares. Para hacerlo, utilice la función:

    Select → Find

    En la ventana tipee la expresión regular. Si este procedimiento falla, y tiene la ventana de las secuencias no alineadas abiertas, ciérrela. Si aún así falla, identifique el motivo utilizando el filtro de conservación.

  2. ¿Todas las secuencias de p53 tienen el motivo de interacción con MDM2?

  3. ¿Todos los motivos MDM2 tienen la misma longitud de secuencia?
  4. ¿Qué nivel de identidad de secuencia observa en esta región? ¿A qué puede deberse?

Ejercicio a informar

Fecha límite de entrega: Viernes, 1 de Noviembre 2024, 23:59hs.

Enunciado

Más del 90 % de los casos de cáncer cervical a nivel global están asociados a la infección del papilomavirus humano con una alta prevalencia de los tipos virales de alto riesgo de la especie Alphapapillomavirus 9, HPV16 y HPV31, y Alphapapillomavirus 7, HPV18 y HPV45. Los tipos virales de bajo riesgo, como HPV11 y HPV6, se encuentran asociados con menor frecuencia a lesiones malignas. En los casos de cáncer atribuidos a HPV los tumores se desarrollan muchos años después de la infección inicial. Por lo tanto, la infección persistente es necesaria para el desarrollo de cáncer invasivo. El mantenimiento del fenotipo transformado depende de la expresión continua de algunos de los genes virales, principalmente las proteı́nas E6 y E7.

La Proteína E7 de papillomavirus contiene un dominio desordenado N-terminal (E7N) y un dominio globular C-terminal (E7C). El dominio E7C media la homodimerización a través de un cisteínas que coordinan un átomo de Cinc.

Info

Para la introducción, se espera que digan brevemente la relevancia de estudiar motivos lineales en una la proteína viral E7.

1. Usando IUPred, long, identifique las regiones desordenadas y globulares.

Piense, analice y discuta:

  • ¿Puede identificar fácilmente el dominio E7N del dominio E7C con el umbral de 0.5? ¿Cambiaría el umbral de 0.5? ¿A qué puede deberse los valores por debajo del umbral observados en el dominio E7N?.

    Se espera que justifique los resultados en base al funcionamiento del algoritmo y su conocimiento en motivos lineales.

2. Analice la proporción de residuos predichos como ordenados y como desordenados utilizando el umbral de 0.4 ¿Se correlaciona esto con lo estudiado en la literatura? Si es que se encuentran diferencias, ¿podría hipotetizar a qué se deben?

3. Knapp et al (Virology, 2009) proponen la existencia de una señal de exportación nuclear en las posiciones 76 a 89 de E7 de HPV16 dada por la expresion regular:

[ILVM]..[ILVMF]...[ILMF]...[ILVMF].[ILVMF]

4. Barbosa et al (EMBO J, 1990) proponen la existencia de dos motivos de fosforilación CKII en las posiciones 31 y 32 de E7 de HPV16 cada uno. El motivo CKII está dado por la expresión regular [ST]..[DE]

  • ¿Cuántas instancias de cada uno de los motivos encuentra en el alineamiento, en qué posiciones y cuáles de estas instancias considera que son buenos candidatos o posibles motivos funcionales? Piense en el contexto estructural y en el grado de conservación (un criterio para clasificar un buen motivo candidato es que esté conservado en >50% de un conjunto de secuencias homólogas).

Atención

Siempre que reporte/mencione una región de una proteína o instancia de un motivo indique las posiciones de inicio y final de la misma y si las posiciones refieren a posiciones del alineamiento o de la secuencia. Para cada respuesta, indicar los algoritmos, base de datos y métodos utilizados, y el criterio usado en cada caso para clasificar/identificar.

Materiales

Ejercicios Adicionales

Ejercicio adicional 1. Un poquito más de expresiones regulares

La reparación del ADN durante la replicación ocurre por un proceso llamado Translesion synthesis (TLS). En este proceso, una polimerasa TLS, inserta un nucleótido en la lesión del ADN y luego, una polimerasa de la familia B extiende el templado. La acción coordinada de estas polimerasas, se logra por la interacción de proteínas scaffold como PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) y la polimerasa TLS Rev1.

Existen estructuras cristalográficas de distintos péptidos unidos a Rev1 (PDBs: 2N1G, 2LSK, 2LSJ, 4FJO, 2LSI y 4GK5) que permiten entender algunas características de la interacción.

La evidencia experimental recolectada de la literatura indica: * La interacción está mediada principalmente por dos residuos consecutivos de fenilalanina (Ohashi,2009). Las fenilaninas interactúan con un bolsillo hidrofóbico en la superficie de Rev1 (Pozhidaeva, 2012; Zhao,2017). * Las fenilalaninas se encuentran en el primer giro de una hélice α. * Se requieren al menos 4 residuos posteriores a las fenilalaninas que formen parte de una hélice (Ohashi, 2009) * El resto de la región de interacción se pliega formando hélices α de longitud variable (Pustovalova, 2016) * En general se observan residuos cargados positivamente en la 2da y/o 3ra posición luego de las fenilalaninas que median interacciones electrostáticas con una superficie acídica de Rev1. Aunque la posición de estos residuos puede variar.

Los siguientes fragmentos de secuencia corresponden a regiones de distintas proteínas que participan en la reparación del ADN y que se unen la proteína Rev1. La interacción se verificó de manera experimental por distintos métodos.

>sp|Q03834|MSH6_YEAST|31-38
SQKKMKQSSLLSFFSKQVPSGTPSKKVQ
>sp|Q04049|POLH_YEAST|625-632
KKQVTSSKNILSFFTRKK   
>sp|Q60596|XRCC1_MOUSE|191-200
DDSANSLKPGALFFSRINKTSSASTSDPAG
>sp|Q9H040|SPRTN_HUMAN|418-428
RPRLEDKTVFDNFFIKKEQIKSSGNDPKYST
>sp|Q15054|DPOD3_HUMAN|236-245
NKAPGKGNMMSNFFGKAAMNKFKVNLDSEQ
>sp|Q9UNA4|POLI_HUMAN|569-579
SCPLHASRGVLSFFSKKQMQDIPINPRDHLS
>sp|Q9Y253|POLH_HUMAN|481-490
TATKKATTSLESFFQKAAERQK VK EA SL SS 
>sp|Q9Y253|POLH_HUMAN|529-539
PFQTSQSTGTEPFFKQKSLLLKQKQLNNSSV
>sp|Q9QUG2|POLK_MOUSE|564-575
LAKPLEMSHKKSFFDKKRSERISNCQDTSRCK
>sp|Q9UBT6|POLK_HUMAN|565-576
FVKPLEMSHKKSFFDKKRSERKWSHQDTFKCE
  1. Copie y pegue las secuencias en el recuadro de Test String en regex101 y prueba encontrar una expresión regular que permita identificar el motivo que media la interacción de estas proteínas con Rev1 y que cumpla con la evidencia experimental observada.
  2. Busque en ELM alguna de las proteínas. ¿Tu expresión regular difiere mucho de la propuesta por ELM?
  3. SlimSearch es una herramienta que utilizando expresiones regulares permite buscar la presencia de motivos en las proteína almacenadas en Uniprot. Vaya a la web de SlimSearch (http://slim.ucd.ie/slimsearch/) e ingrese la expresión regular del motivo como figura en ELM.
  4. ¿Cuántas proteínas obtuviste?
  5. ¿Cuál es la localización celular de Rev1 (Q9UBZ9)? Explore la lista de proteínas. ¿Hay alguna que no tenga la misma localización?
  6. Encuentre en la lista la proteína Kinesin-like protein KIF11 (P52732). ¿Cuál es su localización? ProViz es una herramienta que colecta y muestra información desde distintas fuentes facilitando la detección de motivos lineales.
  7. Ingrese en el servidor de Proviz y busque la proteína Kinesin-like protein KIF11 (KIF11) (P52732). Ubique la región donde se encuentra el posible motivo sugerido por SlimSearch. ¿Está conservado? ¿A qué se debe esa conservación? ¿Te parece que es un posible motivo?

Ejercicio Adicional 2. Familiarizándose con la base de datos ELM.

  1. Realice la búsqueda de la secuencia de la proteína Paxillina (P49023) en ELM, utilizando los parámetros por defecto. Compare los resultados con una búsqueda de la misma secuencia pero modificando el parámetro cellular compartment plasma membrane.
  2. Busque la proteína SRC_MOUSE (P05480) en ELM.
  3. ¿Existen instancias anotadas?
  4. Si no, ¿cuál es la instancia anotada más cercana que se puede encontrar?. Investigue de dónde proviene esta información.
  5. Busque en ELM la proteína MDM4_HUMAN y encuentre el motivo de unión a USP (DOC_USP7_MATH_1). ¿Cuántas instancias del motivo se encuentran en esta secuencia?
  6. Busque en ELM la proteína AMPH_HUMAN y encuentre la clase LIG_Clathr_ClatBox_1.
  7. ¿Cuál es la relevancia biológica de cada una de estas instancias?
  8. ¿La anotación de la relevancia biológica coincide con la estructura globular?
  9. Busque todas las instancias anotadas para Homo sapiens que contienen el término cilium (pista: Usa http://elm.eu.org/elms/browse_instances.html).
  10. ¿Cuántas instancias hay?

  11. ¿Qué evidencia experimental está anotada y cuán confiable es esta evidencia?

  12. Busque todas las instancias anotadas que contienen el término ”retinoblastoma” (Pista: usa http://elm.eu.org/elms/browse_instances.html)

  13. Compare el número de instancias humanas con el número de instancias virales.
  14. ¿Por qué hay tantas proteínas virales que interactúan con retinoblastoma? (Pista: La respuesta está en el abstract de la clase del motivo LIG_Rb_LxCxE_1)